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關鍵詞 分子生物學 兒科 基因工程
中圖分類號：Q7文獻標識碼：A
1 分子生物學為兒科的發(fā)展提供了新的驅動力
兒科這種稱謂源自于歐洲，在15至16世紀之后，受到歐洲文藝復興運動的影響，整個科學技術獲得了極大的發(fā)展，醫(yī)學也不例外，但是這一時期的兒科是包含在產科以及內科里的，產科與內科依據(jù)病兒的年齡分別診斷，也就是說這一時期，兒科并沒有獲得獨立的研究與發(fā)展。世界上第一個兒童醫(yī)院于1820年在法國巴黎誕生，14年之后的1834年俄國建立了世界上第二個兒童醫(yī)院。此后，兒科作為一個獨立學科進入人們的研究視野。早期的兒科研究內容主要針對的是小兒疾病的診治。兒科疾病的診治也主要是依據(jù)成人疾病診治。對于兒童不同年齡所不同的生理、病理現(xiàn)象及其特點認識不足，對于兒童成長的環(huán)境、膳食、營養(yǎng)、衛(wèi)生、保健等影響因素的認識也并不多。此后隨著營養(yǎng)學、免疫學、細菌學等一些學科的快速發(fā)展，學術界對于上述問題也有進一步的認識。到了21世紀，物質代謝、免疫學等學科以前所未有的速度發(fā)展，抗菌素、激素、預防接種等獲得極大發(fā)展，兒科領域的研究也突飛猛進，兒童的營養(yǎng)性以及感染性疾病有了新的控制方法，發(fā)病率與死亡率不斷下降。尤其值得一提的是，以費明翰調查作為典型的第二次流行學革命對于學者們研究兒童的生活方式、心理－行為對疾病模式的意義產生了極大影響，甚至可以說是革命性的，這也是兒科首次對醫(yī)學革命做出的巨大貢獻。
不可否認的是，在分子生物學出現(xiàn)之前，兒科的研究基本上都局限在傳統(tǒng)的疾病診治的經驗桎梏中。分子生物學雖然在20世紀50年代產生之后就是生物學研究的前沿，其深度和廣度是人類有史以來從未達到過的。分子生物學的成果給兒科醫(yī)學的發(fā)展提供了極其廣闊的空間。在傳統(tǒng)兒科研究的主要驅動力中主要包括三個驅動力，也即科學驅動、技術驅動與技巧驅動。在分子生物學產生以前，這些驅動力是分割的，但是分子生物學產生之后為兒科研究的這些驅動力進行了整合，分子生物學在針對兒科研究里的發(fā)現(xiàn)、分析以及解決問題等方面都展現(xiàn)出強勁的展動力?？梢哉f在很大程度上，分子生物學為解決兒科發(fā)展所遇到的一些特殊性、個案性、疑難性問題時提供了清晰的思路、犀利的靈感以及獨特的視角，為兒科的發(fā)展提供了全新的驅動力，從而大大促進了兒科的發(fā)展。
2 分子生物學拓展了兒科研究范圍提高了發(fā)展質量
分子生物學理論主要包括DNA結構、中心法則、基因調控等方面的研究，分子生物學里基因工程的發(fā)展對于傳統(tǒng)的病毒學、生物學以及遺傳學都產生了革命性影響。眾多常見兒科疾病的病原學診斷也獲得了極大的發(fā)展。舉例而言，目前已分離出的呼吸道病毒已超過百種、腸道病毒近百種。這些病毒參與了從呼吸道到消化道以及神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生。疫苗和化學治療的發(fā)展使過去的難治性疾病得到了較好的控制。有關遺傳性疾病（染色體疾病、遺傳代謝性疾?。┰\斷和治療的理論、方法和技術使從前無法認識和處理的上百種疾病有了正確的解釋與治療手段。分子生物學的診斷方法以令人眩暈的速度遍及兒科各個疾病。分子生物學研究所帶來的各種變化極大拓展了傳統(tǒng)兒科學的研究領域，對于兒科學知識的豐富也起了很大作用，尤其是在阿波羅登月以及人類基因組計劃等活動之后，分子生物學的發(fā)展也明顯加速。這也使得人們更進一步的對兒科的疾病、健康以及生命現(xiàn)象本質的研究上達到的一個高峰。人們不再像傳統(tǒng)的兒科研究，只關注兒童疾病的診治了，對于兒童的健康以及生命質量也作為關注的重中之重。對于兒童成長的環(huán)境，研究已經不僅僅局限于自然物質環(huán)境，對于兒童成長的心理精神環(huán)境關注增多。分子生物學的產生及其發(fā)展，在很大程度上使得新一代的兒科研究工作者們所面臨的任務、機遇以及（下轉第53頁）（上接第11頁）挑戰(zhàn)與前輩們發(fā)生了改變，前輩兒科研究工作者的重點在于通過兒童疾病診治降低兒童死亡率和發(fā)病率，當前的研究者重點在于保持這一局面并提高兒童生活和生命的質量。如傳統(tǒng)的研究對于兒童的孤獨癥抑郁癥關注不夠，但是分子生物學產生之后，人們的關注明顯提高了，如北京大學醫(yī)學遺傳中心的鐘南、張茜醫(yī)生在其《兒童孤獨癥的分子生物學研究進展》中專門論述了分子生物學對兒童孤獨癥的影響。分子生物學的產生與發(fā)展也在很大程度上拓展了兒科研究的范圍，大大提高了研究的質量，這種質量的提高主要是通過提供新的途徑與方法來實現(xiàn)的，如朱汝南、錢淵、王芳、劉成貴等人的《分子生物學方法在兒童流行性感冒監(jiān)測中的應用》一問中就認為流行性感冒（流感）病毒是引起急性呼吸道感染的重要病原，它可在短期內突然發(fā)生，起病急，蔓延快，往往造成不同程度的流行，甚至造成世界性大流行。兒科呼吸道感染病人的突然大量增加往往是流感流行的晴雨表，因此兒童中的流感監(jiān)測有著特殊重要的意義。在他們的研究中，充分利用了經典病毒學方法（病毒分離和血凝 （HA）試驗）對兒童中流感流行情況進行監(jiān)測的同時，還建立了分子生物學方法檢測和鑒定流感病毒，并對近年A3型流感病毒分離株的血凝素基因進行了序列分析。又如，著名遺傳學家吳希如在20世紀90年代就逐步建立并開展了兒科分子生物學及分子遺傳學研究。對于分子生物學在小兒驚厥、癲癇及其相關遺傳病機制等領域的影響與作用進行了大量的研究，并取得了豐富的成果。
參考文獻
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關鍵詞 分子生物學 婦科 產前診斷 免疫遺傳
中圖分類號：Q7文獻標識碼：A
1 分子生物學與婦產科的基本情況概述
分子生物學的興起是上世紀50年代以后的事情，但是自其興起和發(fā)展以來，發(fā)展的巨大成就十分引人關注。六十多年來產生了巨大的影響，繁榮的勢頭依然十分強勁。分子生物學研究要進行的問題在于對生命本質一致性的分析，學者們通過分子水平的研究，發(fā)現(xiàn)由最低級、最簡單的單細胞生物到最復雜最高等的人的基本組成（這些組成主要由蛋白質、核酸、糖等三類物質構成）的構成與遺傳信息的物質基礎（主要包括DNA和RNA）、流向（中心法則）以及含義（遺傳密瑪）乃至能量轉換的機理都是高度一致的，正是因此，人們才發(fā)現(xiàn)在分子水平層面，生物取得了相對的統(tǒng)一。分子生物學的這一成就具有極其重要的意義，它使得基因在不同生物個體、種屬之間的轉移成為可能，從而大大的提高了生命科學各個分支學科以及整個生命科學的發(fā)展。在21世紀，分子生物學的發(fā)展將不斷深入和擴大，關于腦的活動、生命發(fā)育、疾病免疫等復雜難題將成為分子生物學研究的重中之重。
要準確客觀理解分子生物學對婦產科的影響，必須對婦產科的基本情況所有了解，在長期的醫(yī)學研究和發(fā)展實踐中，婦產科的研究和實踐內容不斷豐富和發(fā)展，如在生命發(fā)育階段，對胎盤、胎兒生理、母體子宮平滑肌的功能調節(jié)以及分娩發(fā)動機制、早產等問題都有研究。在妊娠期目前對于絨毛外滋養(yǎng)細胞以及胎兒胎盤轉運方面的問題也引起了學界的高度重視。在歐美國家，分子生物科學較為發(fā)達，對生物的基因芯片以及微RNA的研究不斷深入，探討了一些生物學的病理機制及治療方法，典型的如子癇、慢性高原疾病、肥胖等問題。以世界衛(wèi)生組織（WHO）為代表的一些研究結構對婦科流行病學、早產病因基因組研究以及基于循證醫(yī)學早產臨床干預等問題進行了深入研究。
2 分子生物學在婦產科領域的應用與發(fā)展分析
事實上，婦產科的發(fā)展歷史較之于分子生物學要早很多，但是分子生物學興起之后，對婦產科的發(fā)展產生了極大的影響，有些影響甚至可以說是革命性的。比如在女性的產前診斷中，分子生物學的興起使得我們對一些具有嚴重出生缺陷或者遺傳病等問題在宮內期即可作出診斷并及時采取科學合理的對策措施。分子生物學產生之前，該領域主要運用的是胎兒鏡以及影像技術，但是，近年來，致病基因不斷分離克隆，高危胎兒的基因突變分析不僅重要而且必須，分子生物學技術為此提供了可能性，如分子雜交、熒光原位雜交、PCR技術等分子生物學技術在單基因病以及染色體畸變的診斷中獲得了較為廣泛的應用。此外，一些全新的分子細胞遺傳學技術，諸如端粒探針、錨定原位標記技術、基因組雜交等在婦產科的應用問題也已經被提上議事日程。筆者通過以上的分子生物學在產前診斷的應用問題的論述，已經很明顯的說了分子生物學對提高植入前遺傳診斷或用孕婦血中胎兒細胞診斷問題具有十分重要的作用。
當前，應用到婦產科的分子生物學技術是多種多樣，紛繁復雜的，如索森印跡雜交(Southern blot hybridization)、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction）、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization）、單鏈構象多態(tài)性（single strand conformation polymor-phism）、異源雙鏈分析（heteroduplex analysis）、DNA序列分析、蛋白截短測試（protein truncation test）等等，不一而足。這些技術在婦產科的很多具體方面得到了應用與發(fā)展，如在遺傳方面的研究，當前，我們已知一些遺傳性腫瘤（視網膜母細胞瘤、Wilm氏瘤）的突變基因是按孟德爾方式遺傳的。當然也有一些基因與腫瘤的易感性有關，但是其遺傳方式都是孟德爾方式，分子生物學技術可以對這些基因可以進行產前檢查。又如多聚合酶鏈反應這一分子生物學技術的廣泛應用，對于一些婦產方面的疾病，比如Duchenne's肌營養(yǎng)不良癥、囊性纖維化癥、苯丙酮尿癥、脆性X染色體綜合征等進行診斷和治療已經成為可能。再如，分子生物學在母嬰感染傳播方面的應用，超微量的DNA擴增技術具備敏感性、特異性以及簡便性的優(yōu)點在母嬰感染傳播方面的應用優(yōu)勢十分明顯。分子生物學的應用使得對于母嬰傳播方面存在可能的人類免疫缺陷病毒（HIV）、巨細胞病毒（CMV）、風疹病毒等進行一些提前的檢測與預防成為可能。值得一提的是利用PCR技術還可以根據(jù)不同引物的特點進行預后。近年來，丙型肝炎病毒（HCV）的母嬰傳播已成為一個研究熱點，PCR技術在這一領域也取得了諸多成就。此外，在婦科腫瘤基因研究方面，目前學界對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的認識進入了分子水平。在分析腫瘤細胞中復雜的染色體異常組成以及對癌基因的定位及其抑制方面都有貢獻。當前免疫遺傳研究熱點是人類白細胞抗原系統(tǒng)（human leucocyte antigen，HLA）與該病的關系。分子生物學技術的應用使HLA分型研究從抗原水平進入到基因水平，使與疾病關聯(lián)的HLA基因準確分型、定位。以上所舉的一些也只是分子生物學在婦產科領域應用和發(fā)展的冰山一角，我們有理由相信，隨著分子生物學和婦產科的不斷交叉融合，兩個學科以及交叉部分都會取得更多嶄新的成就。
參考文獻
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關鍵詞：土壤微生物生態(tài)學；核酸探針雜交；梯度凝膠電泳；PCR
土壤中存在著極其豐富的微生物種類，它們在土壤生態(tài)系統(tǒng)中各自行使著獨特的功能。自1953年以來，分子生物學理論和技術取得了驚人的成就，許多分子生物學研究方法和理念被應用到微生物生態(tài)學研究中，為微生物生態(tài)學研究領域注入了新的活力，極大地推動了微生物分子生態(tài)學的發(fā)展。下面介紹近年主要的幾種研究方法：
一、標記核酸探針雜交技術
1.基本原理
以核酸分子雜交技術為核心，利用探針分析DNA序列及片段長度多態(tài)性。探針是能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補的已知核酸片段，它可以是長探針（100～l000bp），可以是短核苷酸片段（10～50bp），也可以是從RNA制備DNA探針，斑點印跡和狹線印跡雜交等不同的方法。
2.應用
科學家應用核酸雜交方法研究了被燃油污染及不污染的土壤提取的細菌DNA，結果表明：被污染的土壤提取的細菌DNA中各種烴的降解基因的檢出率顯著高于不污染的樣品，且定量分析結果表明污染越嚴重，這種降解基因的含量越高，因而可以用該方法作為對土壤中燃油污染程度的評價。
3.原位熒光雜交技術
（1）基本原理。FISH是以熒光標記取代同位素標記的一種新的原位雜交方法。它檢測核苷酸序列是利用熒光標記的探針在細胞內與特異的互補核苷酸序列雜交，通過激發(fā)雜交探針的熒光來檢測信號。
（2）應用及其優(yōu)缺點?？梢赃M行樣品的原位雜交，應用于環(huán)境定微生物種群鑒定、種群數(shù)量分析及其特異微生物跟蹤檢測，現(xiàn)已成為微生物分子生態(tài)學研究中的熱點技術，在土壤微生物分子生態(tài)學領域應用廣泛。FISH技術的應用受到環(huán)境樣品微生物的生理狀態(tài)的影響，芽孢、放線菌及休眠時期的細胞的細胞膜的通透性低，影響群落中部分種屬豐度的錯誤估計。
二、基于PCR技術的研究方法
PCR是一種聚合酶鏈式反應技術，主要特點是短時間內在實驗室條件下人為地控制并特異擴增目的基因或DN段，使研究的目的基因及其環(huán)境樣品中的微量微生物基因得到無限的擴增，為這些基因和微量微生物種群的研究提供了保證。
1.PCR-RFLP方法
（1）原理。PCR-RFLP法是將PCR引物中的一條加以熒光標記，其基本原理是用PCR擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。
（2）應用。現(xiàn)在很多研究人員利用16SrRNA來研究土壤微生物的多樣性。該技術還可以用來監(jiān)測因環(huán)境改變而引起的微生物種群的變化。
2.PCR-SSCP方法
（1）原理。日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DN段呈復雜的空間折疊構象，這種立體結構主要是由其內部堿基配對等分子內相互作用力來維持的。當有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構象，使構象發(fā)生改變?？臻g構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以非常敏銳地將構象上有差異的分子分離開。
（2）應用。Sabine Peters等人用該法研究群落的演替和菌種的多樣性，并同傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法比較指出PCR-SSCP方法避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)的費時費力以及誤差大的干擾，適合對微生物群落結構和演替的分析。
三、DNA擴增片段梯度電泳檢測技術
1.變性梯度凝膠電泳
（1）基本原理。雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。DGGE技術在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DN段區(qū)分開來。
（2）應用。DGGE方法是應用最早也是最常用的單堿基突變篩查方法之一，自從1993年DGGE被引入微生物學以來，該技術被廣泛地用作分子工具比較微生物群落的多樣性以及監(jiān)視種群動態(tài)。PCR-DGGE用于分析華盛頓州東部4種土壤細菌群落結構和多樣性，結果表明：管理和農學實踐對細菌群落結構的影響比年降水量更大。
2.溫度梯度凝膠電泳
（1）基本原理。溫度梯度凝膠電泳技術則是利用溫度梯度變性的原理，利用了不同分子在溫度改變下構象的差別進行分離。
末端端粒的長度，隨著年齡的變化而變化。因此，可以用分子生物學方法準確推測年齡。
【關鍵詞】d型／l型天冬氨酸，堿基加合物和正常堿基，端粒，分子生物學，年齡
【中圖分類號】13919．2；075
【文獻標識碼l a
【文章編號】1007—9297(20__)01—0040—02
在法醫(yī)學實踐中，經常需要對無名尸體、組織碎塊進行
年齡估計。一般情況下應用法醫(yī)人類學方法對牙齒、骨骼
等檢材估計個體年齡。而在很多情況下，現(xiàn)場僅有組織碎
塊存在，或者有的部位的骨骼不適合精確估計年齡，在這種
情況下用分子生物學方法估計年齡，尤為重要。體內的許
多物質隨著年齡的變化而發(fā)生改變，目前有幾種物質隨著
年齡的改變而發(fā)生變化，一種是質的變化，一種是量的變
化。
膠質原存在于人體的各種組織、器官中，膠質原含有d
型、l型天冬氨酸。尤其在牙釉質、牙本質中，d型、l型天
冬氨酸的含量隨著年齡的增加會發(fā)生改變，d型天冬氨酸
隨著年齡的增加而增加，而l型天冬氨酸隨著年齡的增加
而發(fā)生消旋作用，轉變?yōu)閐型天冬氨酸而含量下降。d型／
l型天冬氨酸的比值隨著年齡的增加而增加。在牙本質中
這種變化較穩(wěn)定，適合于用d型／l型天冬氨酸估計個體的
年齡_1 j。國外許多學者建立了利用天冬氨酸的消旋作用
推測年齡的方法。20__年，pilin等利用此方法計算15～95
歲之間的樣本，年齡與d／l型天冬氨酸的比值的關系，其
相關系數(shù)達到0．93。此方法的優(yōu)點在于當牙齒的形態(tài)遭到
嚴重破壞時，可以利用牙本質中天冬氨酸的穩(wěn)定性來估計
個體年齡。此方法在實際應用中，水解蛋白質和手性分離、
檢測氨基酸的衍生物尤為重要，影響結果的準確性，可應用
gc、hplc、毛細管電泳進行手性分離和檢測ll 。
隨著年齡的增長，人體的體細胞線粒體產生的自由基
增多，自由基的增多會對dna產生損傷。尤其活性氧弓l起
的dna氧化性損傷，導致堿基結構的損傷，進而引起dna
在體內復制時發(fā)生突變。自由基對核dna和線粒體dna
都會產生損傷，由于線粒體dna沒有組蛋白和hmg蛋白
的保護，更容易產生損傷【6-8 。活性氧對dna的損傷，表
現(xiàn)在dna的堿基形成加合物，在復制過程中，這些堿基產
生錯配，導致突變?；钚匝跏墙Y構最簡單、穩(wěn)定性最差、氧
化性最強、與四種堿基的反應活性最強的自由基，因此在細
胞中最多見的是活性氧導致的堿基損傷，活性氧攻擊堿基
的不飽和鍵形成堿基加合物。人體也存在抗自由基損傷的
修復能力，但隨著年齡的增加，修復能力下降?；钚匝蹩珊?/p>
堿基形成8一oh—g、5一oh—dg、5一oh—du、8一oxo
— da，dug、2一oh—da堿基加合物_6 j。通過對動物細
胞和體外培養(yǎng)細胞的研究，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長細胞的堿
基加合物含量會增加，其中8一oh—da、8一oh—g含量
最多。檢測堿基加合物和正常堿基的含量，可用于推測個
體的年齡，但這種方法只能粗略估計年齡，適合于組織碎塊
的年齡估計。
在人類染色體的末端存在端粒，端粒由蛋白質和dna
組成，真核生物的線型染色體都存在端粒。端粒dna不存
在蛋白質編碼基因，端?；居闪塑账岷诵闹貜蛦挝?/p>
(111aggg)組成，其中有的重復單位存在變異，重復序列問
亦存在一些插人序列。端粒雖然不存在功能基因，但端粒
起著穩(wěn)固基因組、保護染色體末端、決定核內染色體定位作
用及調控體細胞復制作用l9 。由于端粒調控著體細胞
的分裂、復制，體細胞分裂、復制有一定復制生命周期，端粒
決定體細胞分裂次數(shù)，可以說是細胞分裂的“生物鐘”，因為
端粒不能進行半保留復制，其復制依賴于端粒酶的存在。
大部分體細胞不存在端粒酶，體細胞每分裂一次，端粒就丟
失一段，隨著細胞分裂而不斷縮短，因而端粒的長度反映細
胞復制歷史。也可以說端粒長度隨著個體的年齡變化而縮
短，反映生物個體的年齡變化。而端粒長度的變化不受體
法律與醫(yī)學雜志20__年第1o卷(第1期)
外因素的影響。細胞每分裂一次，不同的細胞縮短的長度
不同，因此端粒長度可以作為推斷年齡的一個理想標
記[1卜15]。
端粒長度的檢測方法目前有trf(末端限制性片段
法)、fish(熒光原位雜交法)、 a(雜交保護法)等。這些
方法檢測都是46條染色體端粒的平均長度，而不同染色體
的端粒長度存在差別，以及同一染色體的兩個端粒亦存在
差別[16]。通過檢測平均長度而推測年齡，誤差較大。如果
能準確檢測一個端粒的長度，推測年齡準確性將大大提高。
隨著分子生物學和分子遺傳學及相關技術的發(fā)展，用
分子生物學方法可以準確推測個體的年齡。
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[關鍵詞] 早期宮頸癌；復發(fā)；分子生物學
[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）10-39-03
宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤。宮頸癌死亡率每年大約26萬，其中80%發(fā)生在發(fā)展中國家，HPV16和18是最常見的兩種致宮頸癌的病毒，70%的宮頸癌由這兩種病毒引起[1]。近年來采用陰道脫落細胞圖片檢查的普及，使不少宮頸癌患者能早期發(fā)現(xiàn)、早期治療，提高了患者的生存期。但臨床發(fā)現(xiàn)宮頸癌年輕化傾向明顯，25～54歲人群發(fā)病率不降反升[2]。導致早期宮頸癌復發(fā)的因素較多，許多國內外學者對早期宮頸癌的各方面進行了大量的研究分析，得出了很多與早期宮頸癌復發(fā)有關的原因。本資料通過對國內外最近五年相關文獻資料的研究學習，總結導致早期宮頸癌復發(fā)的分子生物學因素。
1 宮頸上皮細胞間質轉化
大量的研究表明宮頸上皮細胞間質轉化（EMT）與宮頸癌的形成和轉移復發(fā)有密切關系。
1.1 上皮細胞間質轉化（EMT）
正常的上皮細胞靠專門的細胞間粘附力緊密連接在一起，而且具有頂-基底極性。間質細胞形似紡錘體，連接松散，流動性強，具有前-后極性。上皮細胞通過復雜的程序轉變成間質細胞的過程稱為上皮細胞間質轉化。上皮細胞轉變?yōu)殚g質細胞后會失去原來的特性，中間會形成一種亞穩(wěn)定的細胞既有上皮細胞又有間質細胞的特性，這是一種很多腫瘤都有的過程[3]。上皮細胞間質轉化有3種類型，其中第3型存在于腫瘤的侵襲與轉移中[4]。宮頸上皮細胞通過EMT過程，形成上皮樣的癌細胞失去極性，不穩(wěn)定，但是還具有上皮細胞的其他特性，經惡化和分化形成具有轉移、侵襲能力的癌細胞。癌細胞離開原始位置，侵入基底膜下，侵入血管和淋巴管隨血液轉移到另一個地方形成轉移灶。在這過程中，還有以下因素參與，干細胞機制[5]、抗吞噬作用[6]、免疫逃避、藥物抗性等。
1.2 EMT的分子生物學
上皮細胞間質轉化的標志性分子變化主要有：（1）E-鈣粘蛋白和β-連環(huán)蛋白的下調。E-鈣粘蛋白和β-連環(huán)蛋白的下調與早期宮頸癌的組織學分化、轉移和復發(fā)成正相關[7]。（2）N-鈣粘著糖蛋白、纖維連接蛋白以及波形蛋白的上調表達。波形蛋白的上調表達與早期宮頸癌的轉移、復發(fā)成正相關[7]。（3）Rho GTP酶介導的細胞骨架重排。RhoC在正常宮頸組織、CIN 組織和宮頸癌組織中的表達逐漸增高，在有淋巴結轉移的宮頸癌組織中的表達明顯高于無淋巴結轉移組織，同時RhoC的沉默可以明顯降低SiHa細胞的體外粘附能力和侵襲、遷移能力[8]。（4）調控EMT的基因轉錄因子的上調和易位，如Twist1、Twist2、Snail、Slug、Six1等。Twist1、Twist2和E47抑制E-鈣粘蛋白的表達以及調節(jié)其它基因功能誘導EMT過程[9]。
1.3 EMT的信號通路
上皮間質轉化的信號通路有轉化生長因子（TGF-β）通路、Wnt通路、Notch通路、NF-κβ通路等。這些通路相互作用，共同調節(jié)EMT的過程[10]。
1.3.1 TGF-β信號通路 TGF-β是一組具有廣泛生物活性的多肽，哺乳動物中有三種亞型TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1是TGF-β相關的致瘤作用研究的重點，TGF-β1在腫瘤細胞中是上調的[11]。TGF-β通過細胞膜表面具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的TβR Ⅰ和TβR Ⅱ結合形成復合物。TβR Ⅰ有ALK1/TSR-1、ALK1/TSK7L、ALK5/TβRⅠ 3種受體，TβR Ⅱ只有一種受體。TGF-β與TβR Ⅱ結合形成復合物使TβR Ⅰ磷酸化，隨之smads被磷酸化，誘導該復合物進入細胞核；這一信號通路受到干擾發(fā)生異常，與腫瘤的發(fā)生有重要關系[12]。與TGF-β信號通路影響細胞核內轉錄的因子有smad、Ras、Rho、TAK1、PP2A、β-catenin 以及NF-κβ、ATF2等。Smad7和TGF-β1與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展、臨床分期、侵潤和淋巴結轉移相關[13]。Stephanie等[14]的研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號通路在EMT過程中起著重要作用，從而導致癌細胞具有侵襲和轉移能力。Iancu等[15]研究TGF-β通路在HPV誘導的宮頸癌中發(fā)現(xiàn)TGF-β通路的破壞與宮頸惡性進展有很大關系；在宮頸上皮樣瘤變到宮頸癌的過程中TGF-β1表達減少；同時TGF-β1受體基因表達也下降。
1.3.2 Wnt信號通路 Wnt信號通路有經典的Wnt信號通路、Wnt/ca+通路、Wnt/PCP通路，其中經典通路最重要，通過β-catenin激活基因轉錄；其機理概括為WntFzdDshβ-catenin降解復合體解聚β-catenin入核TCF/LEF基因轉錄[16]。參與Wnt信號通路的蛋白有Frizzled、Dishevelled、Gsk3β、CK1、APC、β-catenin等。Wnt信號通路受到刺激后，APC基因突變使β-catenin降解復合物合成障礙，以及β-catenin基因突變使β-catenin不能被磷酸化和泛素化降解，從而使β-catenin降解障礙，胞漿內游離的β-catenin聚集，進入核內激活Cyclin D1、C-myc等基因轉錄，導致腫瘤發(fā)生。細胞核的Survivin、Cyclin D1受Wnt通路的激活[17]，影響宮頸癌的復發(fā)和轉移。Survivin、P21、Cyclin D1蛋白對早期宮頸癌復發(fā)的影響中發(fā)現(xiàn)，三者在早期宮頸癌中的表達明顯升高，并且三者共表達時與臨床分期、病理分級有關；Survivin、Cyclin D1表達與早期宮頸癌復發(fā)有關，二者共同表達與盆腔淋巴結轉移有關[18]。
1.3.3 Notch信號通路 Notch信號通路是腫瘤血管生成和轉移的一個關鍵因素[19]。Notch信號通路由Notch、Notch配體（Jagged）、受體等組成，其中配體有Delta-like1、3、4，Jagged1、2，CSL，受體有Notch1、2、3、4，Notch信號通路在不同的腫瘤以及不同的階段作用不同。Notch信號通路概括為DeltaNotch酶切ICN細胞核CLS/ICN復合體基因轉錄[19]。Notch1中有Notch1-RBP-Jκ路徑、Notch1-PI3K-PKB-Akt路徑、Notch1-IKK-NF-κB路徑共同相互影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[20]。Bajaj等[21]研究發(fā)現(xiàn)CD66+細胞中Notch信號通路對宮頸癌有重要作用。免疫組織化學分析顯示Notch3在宮頸鱗癌中過度表達，Notch陽性表達的宮頸癌患者比陰性表達的患者的生存率小[22]。
1.3.4 NF-κB信號通路 基本的NF-κB信號通路包括受體、受體近端信號銜接蛋白、IκB 激酶復合物、IκB 蛋白和NF-κB二聚體。受到刺激后IκB 激酶復合物被激活，IκB 蛋白磷酸化和泛素化，IκB 蛋白被降解，NF-κB二聚體釋放修飾后進入細胞核內，進行基因轉錄。NF-κB一般情況下位于細胞胞漿內，由兩個功能亞單位P65和P50組成，與其抑制因子IκB-α和IκKB-β結合在一起。宮頸癌中IκB-α的去磷酸化使IκB-α減少，從而NF-κB的P65進入細胞核內[23]，參與細胞核內基因的表達調控。NF-κB激活對腫瘤的促進作用主要有：（1）①NF-κB激活對宮頸癌的轉移有明顯促進作用[24]；（2）NF-κB的GADD45α和γ表達下調使腫瘤細胞逃避凋亡；（3）NF-κB上調Cyclin D1等，促進腫瘤細胞生長。NF-κB的P65和c-IAP2的過度表達和caspase-3的下調，是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素[24]。
2 小結
目前國內外對早期宮頸癌治療后復發(fā)的因素研究較多，都認為復發(fā)是由于多方面、多路徑的因素共同作用的結果。發(fā)現(xiàn)復發(fā)轉移的關鍵因素，提高患者的生存率，減輕患者的痛苦是有必要的。除EMT、VEGF信號通路、notch信號通路等，是否可以發(fā)現(xiàn)更多關鍵的分子生物學層面的相關因素，使早期宮頸癌能更早的發(fā)現(xiàn)，得到早期治療，阻斷關鍵的分子生物路徑，減少復發(fā)率。
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【關鍵詞】 子宮腺肌病;血管生成;免疫
Abstract:Adenomyosis (AM) is the common disease in department of gynaecology. In clinical aspect， it has the characteristics of implantation，recurrence and invasive growth of endometrial tissues which are similar to biological behaviors of malignant tumors. However， their mechanisms have not been well-clarified yet. The pathogenesis of human adenomyosis might be correlated with the factors of vascular formation， immune， apoptosis， neurophysin receptor and heredity
Key words:adenomyosis(AM);vascular formation; immune
子宮腺肌病(adenomyosis)是指具有生長功能的子宮內膜腺體和間質在多種致病因素的作用下侵入子宮肌層而引起的以經量過多、經期延長、繼發(fā)性痛經漸進性加重為主要臨床表現(xiàn)的良性病變。該病首次由Frank命名，為良性疾病，但在生物學行為上具有粘附、侵襲、轉移等許多類似惡性腫瘤之處。近年來，隨著分子生物學和現(xiàn)代診斷技術的發(fā)展，許多學者對本病的發(fā)病機制進行了深入的研究，提出了許多相關因素。現(xiàn)就近年來有關本病發(fā)病機制的分子生物學研究概況綜述如下:
1 血管生成與子宮腺肌病的相關性
近年來血管因子在細胞的增生、遷移發(fā)生過程中的重要意義受到學術界的重視。研究表明，血管生成可能在子宮腺肌病發(fā)病過程中起重要作用[1]。Han[2-3]用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病的子宮內膜和肌層的血管生成活性顯著升高。Hirotaka[3]通過宮腔鏡檢查發(fā)現(xiàn)近一半的子宮腺肌病內膜有異常血管形成。某些血管生成因子活性增高或是抑制因子活性降低，或兩者平衡失調，經過一系列過程形成新生血管，其中至少包括微血管基底膜和細胞外基質的降解，血管內皮細胞遷徙及增殖分裂，新的原始血管分化成熟，最后形成新的毛細血管。以上過程受到多因素的調節(jié)，如血管生成因子、細胞因子、整合素家族和其他黏附分子、成纖維生長因子、蛋白水解酶、透明質酸酶及小分子物質等，其中血管生成因子家族在血管生成中起著非常重要的作用，該家族包括血管內皮生長因子(VEGF)、血小板來源的內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、腫瘤壞死因子(TNF)等，而VEGF是最為關鍵的因素，其他因子最終都是通過它而發(fā)揮調節(jié)血管形成作用。
VEGF通過增加血管通透性，改變血管細胞基因表達，促進血管內皮細胞的有絲分裂等途徑導致新生血管形成，成為目前公認的最關鍵的促血管形成因子，是參與調控血管生成的最重要的血管生長因子，它在組織中的表達反映了該組織的血管生成活性。
2 免疫與子宮腺肌病的相關性
免疫系統(tǒng)是機體的一個重要功能系統(tǒng)，擔負著免疫防御、免疫監(jiān)視與免疫自穩(wěn)的功能，但免疫系統(tǒng)功能失調可引發(fā)或促進疾病。近年國外有研究表明，子宮腺肌病患者的細胞免疫和體液免疫均增強，免疫功能失調在子宮肌腺病的發(fā)病中可能起一定的作用[4]。
2.1 細胞免疫
(1)免疫細胞：包括T細胞、B細胞、單核- 吞噬細胞、NK細胞等。正常的子宮內膜間質中具有一定數(shù)量的免疫細胞，約占子宮內膜間質細胞的10%～15%，主要成分為T細胞與巨噬細胞，免疫細胞數(shù)量及功能的異常與子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展密切相關。Propst 等[5]用免疫組化染色證實子宮腺肌病組織確實表達巨噬細胞單克隆刺激因子(GM – CSF)，且GM - CSF 配體的表達在子宮腺肌病組織腺上皮比在位內膜明顯增加，尤其在月經周期的分泌期更明顯。表明子宮腺肌病腺上皮產生的GM- CSF 配體水平上調，可能在子宮腺肌病活化的巨噬細胞水平的增加上起作用。
(2)細胞因子：細胞因子( cytokine， CK)是指由免疫細胞和某些非免疫細胞(如血管內皮細胞、表皮細胞、成纖維細胞)經刺激而合成、分泌的一類小分子蛋白質，主要調節(jié)免疫應答、參與免疫細胞分化發(fā)育、介導炎癥反應、刺激造血功能并參與組織修復等。免疫細胞數(shù)量及功能的異常，導致其分泌的細胞因子發(fā)生變化，而細胞因子的變化，又可影響局部一些生長因子的活性，從而引發(fā)疾病。
ENA-78屬于趨化性細胞因子超家族，主要來源為活化的巨噬細胞，對中性粒細胞有特異性趨化作用。有研究顯示，子宮腺肌病患者體內存在著一系列的免疫反應，包括細胞表面抗原表達增強、巨噬細胞活化及免疫球蛋白和補體成分的沉積，激活的免疫細胞分泌不同的細胞因子或生長因子，如IL-1、TNF、IFN-γ等，形成復雜的細胞因子網絡， ENA-78是其中一個重要環(huán)節(jié)，有學者報道在子宮內膜上皮細胞產生ENA-78和IL-8可增加IL-1、TNF、IFN -γ的量[6]。
基質金屬蛋白酶(MMPS)是一類降解細胞外基質的酶，主要參與細胞外基質的重建，在很多生理和病理過程中發(fā)揮作用。Qiu F等[7]于2006年研究認為，AM異位內膜組MMP-2的表達顯著高于在位內膜組，提示MMP-2的過度表達使內膜的侵襲力增強，異位內膜組織能降解包括基底膜在內的ECM成分，破壞了阻止子宮內膜侵入的“天然屏障”，為AM異位病灶的形成提供了條件。
E-cadherin屬粘附因子家族，其功能主要是調節(jié)細胞與細胞之間的黏附反應，對維持組織結構形態(tài)起重要作用。有學者研究發(fā)現(xiàn)，在月經周期的各個階段，子宮內膜中E-cadherin都有表達，而在分泌期明顯高于增殖期，主要在上皮細胞表達。子宮腺肌病是雌激素依賴性疾病，子宮內膜分泌雌二醇、孕酮能力增強或其受體表達能力增加，使局部激素水平上升，從而導致E-cadherin表達增強。在妊娠、流產等因素作用下，子宮內膜、子宮內膜—子宮肌層連接區(qū)、子宮肌層受到損傷，而高表達E-cadherin的子宮內膜腺上皮細胞有較強的黏附力，在其與子宮內膜接觸后，黏附并在子宮肌層生長，形成異位的子宮內膜，發(fā)生子宮腺肌病，這也解釋了肌層中的異位內膜與宮腔表面的子宮內膜有直接通道相連的病理表現(xiàn)。我們認為E-cadherin在子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了一定作用。
(3)人類白細胞抗原( human leucocyte antigen，HLA)是人類主要組織相容性抗原，由抗原呈遞細胞使抗原內在化并降解、加工抗原，然后作為免疫原復合物釋放至細胞表面。HLA-DR(主要組織相容性復合物- Ⅱ型抗原(MHC - Ⅱ))是經典的HLA基因之一， 其被巨噬細胞識別，進而激活T細胞并刺激B細胞產生抗體，研究結果[8]顯示子宮腺肌病的在位和異位內膜腺上皮細胞中HLA-DR 抗原的表達比正常子宮內膜明顯增高， HLA-DR 優(yōu)先分布于子宮腺肌瘤的腺上皮細胞，且分泌期高于增殖期。HLA-DR抗原表達升高引起抗原傳遞以及其后的免疫反應異?？赡苁亲訉m腺肌病發(fā)病的原因之一。
2.2 體液免疫
在子宮腺肌病患者的外周血中存在自身抗體，如磷脂次黃嘌呤IgG、磷脂酰甘油IgG和磷脂酰絲氨酸IgG的增高，在切除子宮或使用達那唑治療后，這些抗體明顯下降，說明了與自身免疫性疾病和反復流產有關的抗磷脂抗體的存在，也預示了該病患者常常伴發(fā)不孕和體外受精成功率低。同時，相關研究報道補體系統(tǒng)通過沉積C3和C4也參與子宮腺肌病的免疫調節(jié)。
3 細胞凋亡與子宮腺肌病的相關性
細胞凋亡又稱程序性死亡(PCD)，指有核細胞在凋亡刺激信號的作用下，通過啟動細胞內死亡機制，經過一系列信號傳導途徑，最終發(fā)生細胞程序性變性和壞死的主動死亡過程，是受高度調節(jié)的生理過程，它與細胞有絲分裂相互協(xié)調，共同調控胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、正常組織的更新，同時消除多余、衰老和受損傷的細胞，以維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定[9]。目前， 已經認識到， 細胞凋亡不僅參與了胚胎發(fā)生、組織塑形、造血調控、發(fā)育、生殖、老化、免疫等生理過程， 而且與病毒感染、增殖性疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生及治療有關。子宮腺肌病是一種增殖性疾病，因此它的發(fā)生可能與凋亡調控基因有關。
Survivin 基因：Survivin (生存素)作為凋亡抑制蛋白( inhibitor of apop tosisp rotein， IAP)家族中的新成員， 越來越受到學者們的重視。Survivin 位于17q25染色體上，與細胞分裂、增生有關，是目前發(fā)現(xiàn)的最強凋亡抑制基因，是通過直接抑制凋亡通路下游的caspase - 3 (半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶- 3 )和caspase - 7而發(fā)揮抗凋亡作用[10]。Survivin主要分布于胚胎及分化不成熟的組織中，在正常成人分化成熟組織一般不表達[11]。生存素高表達時能促進細胞增殖，參與調節(jié)細胞的有絲分裂，并能對抗各種凋亡誘導因子如IL-3、TNF-α、Bax、Fas和某些抗癌藥物及放射線等的作用，可調節(jié)細胞周期，并可參與血管生成，而一些細胞因子如血管內皮生長因子(VEGF)還可以促進生存素再表達[12]。湯淼等[13]采用免疫組化抗生物素蛋白-過氧化物酶染色法(SP法)檢測Survivin在AM (子宮腺肌病)中的表達發(fā)現(xiàn): 腺肌病中異位內膜生存素高表達，細胞凋亡抑制作用增強，增生增加，使異位內膜細胞存活期延長，細胞死亡與增生失衡，過度的增生使增生性疾病發(fā)生。由此推測，生存素引起的凋亡抑制可能是腺肌病發(fā)生的一個因素。
4 激素、受體蛋白與子宮腺肌病的相關性
子宮腺肌病通常被認為是一種雌激素依賴性疾病， 多見于育齡期婦女，絕經后異位的內膜組織逐漸萎縮被吸收，如使用雌激素替代療法可使原病變復發(fā)，其異位內膜也隨卵巢分泌的甾體激素周期性變化而改變，均提示本病與雌激素水平相關。目前雌激素在子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展中的重要作用已經得到公認。
Noel JC[14]等發(fā)現(xiàn)子宮內膜異位癥腺體、間質及肌層均有PR (孕激素受體)及ER (雌激素受體)的表達，且主要集中在異位病灶，在月經周期的各個階段均為PR>ER，除直腸陰道異位病灶外(增生期PR及ER的表達水平高于分泌期)，其他部位異位病灶無明顯周期性變化。還有學者發(fā)現(xiàn)異位病灶本身還能分泌雌激素，因異位內膜中雌激素合成酶的含量增加，使組織中的雌激素水平異常增高所致，這些酶包括芳香化酶細胞色素P450、17p羥類固醇脫氫酶2型、硫酸雌酮脂酶。異位間質細胞芳香化酶高表達和雌激素濃度增加，促進環(huán)氧合酶- 2 (COX - 2)活性，增加前列腺素PGE2 生成[15]。反過來， PGE2通過增強異位內膜芳香化酶活性，進一步促進雌激素生成，如此芳香化酶- 雌激素- 前列腺素在子宮內膜異位組織內形成正反饋調節(jié)循環(huán)。動物實驗中發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病的小鼠血清中有高水平的催乳素，子宮催乳素受體表達也增加;研究還發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病異位子宮內膜腺上皮絨毛膜促性腺激素、黃體生成素的受體基因mRNA 和受體蛋白的表達明顯高于在位子宮內膜，而間質細胞的表達無明顯差異，提示子宮內膜腺上皮絨毛膜促性腺激素、黃體生成素受體表達水平的升高與子宮腺肌病的發(fā)生有關。
5 遺傳基因與子宮腺肌病的相關性
Patois等[16]發(fā)現(xiàn)異位子宮內膜間質細胞可見染色體(7q) (q21.2. q31.2)部位缺失。Zong 等[17]發(fā)現(xiàn)HLA - DQA1 0301 和0401 等位基因與子宮腺肌病和子宮內膜異位癥均有關，兩者可能在HLA - DQA1 和HLA - DRB1 等位基因頻率上有共同的發(fā)病機制。此外，還有眾多關于癌基因與子宮腺肌病的研究，p53、MDM2、和p21Waf1都是癌基因蛋白，他們都具有調節(jié)細胞周期的能，Anas-tasiaa[18]等的研究發(fā)現(xiàn)這些癌基因蛋白在子宮內膜異位癥中表達而在子宮腺肌病不表達，p53， MDM2，和p21Waf1癌基因蛋白的表達表明了這些癌基因蛋白在調節(jié)子宮內膜異位癥的細胞生長中起作用，但是在子宮腺肌病中沒有調節(jié)作用。近年研究還發(fā)現(xiàn)，氧自由基代謝失衡可引起組織細胞發(fā)生破壞性的反應，與子宮腺肌病的發(fā)生有一定的相關性。同時，多次妊娠分娩及宮腔操作均可造成子宮內膜和淺肌層的損壞，有利于基底細胞增生并侵入子宮肌層。
綜上所述，子宮腺肌病雖為良性病變，但具有惡性腫瘤遠處轉移、種植和生長的惡性生物學行為，探討本病的發(fā)生機制有利于臨床選方用藥及新藥的研發(fā)，提高本病的治愈率，減少遠期復發(fā)率。
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關鍵詞：豬傳染性胃腸炎；病毒分子；生物學檢測方法
中圖分類號 S858.28 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）12- 0110-02
豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）導致豬出現(xiàn)脫水、水樣腹瀉以及嘔吐等為主要臨床癥狀的高度傳染性疾病，該病在春季、初秋以及冬季具有較高的發(fā)病率[1]。豬傳染性胃腸炎最早發(fā)生于美國，隨后在世界各地均有發(fā)生，我國于20世紀50年代首次發(fā)現(xiàn)該病，目前全國大部分地區(qū)均發(fā)生過豬傳染性胃腸炎。不同日齡和品種的豬均可以感染傳染性胃腸炎，其中以15日齡左右的仔豬發(fā)病后死亡率最高，高達100%；5周齡以上的仔豬感染傳染性胃腸炎后死亡率較低，但是會影響仔豬后期的生長，降低仔豬的飼料利用率。目前，該病已被世界動物衛(wèi)生組織列為B類必檢傳染性疾病。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，該技術已經廣泛用于各種細菌性和病毒性疾病的檢測[2]。本文綜述了分子生物學技術在傳染性胃腸炎中的應用，以期能為從事傳染性胃腸炎診斷和防控的工作者提供幫助。
1 傳染性胃腸炎病毒基因組結構和基因表達方式
1.1 TGEV基因組結構 傳染性胃腸炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，該病毒的基因組不分節(jié)段、單股正股RNA，具有高度傳染性。傳染性胃腸炎基因組全序列分為7個區(qū)29kb，結構序列為5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且該基因組的3'-末端以共價鍵結合的poly結構，5'末端有帽結構[3]?；蚪M1約有20kb，主要負責病毒的編碼，其余基因均在近3'端。傳染性胃腸炎病毒全基因組編碼由4種結構蛋白和3種非結構蛋白組成，其中基因7、基因3和基因1為非結構蛋白，N、M、sM、S為傳染性胃腸炎的結構蛋白。
1.2 基因表達方式 傳染性胃腸炎病毒在胞漿脫殼以后，其正鏈RNA就呈現(xiàn)了mRNA的功能，使基因1轉錄表達RNA聚合酶，同時該基因有作為模板合成負鏈RNA，進而親代RNA與負鏈RNA形成雙鏈復制中間體。因此，在感染傳染性胃腸炎病毒的細胞內，可以檢測出不完全RNA、基因組RNA、mRNA以及雙鏈中間體4個特異性RNA，這可以作為豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學檢測指標之一[4]。
2 結構蛋白及功能
豬傳染性胃腸炎病毒的結構蛋白主要為S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是豬傳染性胃腸炎病毒纖突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，該蛋白基因全長4.3kb，蛋白分子量為195～220ku；S蛋白不僅是決定豬傳染性胃腸炎病毒抗原的重要結構，也影響著病毒對細胞的致病性、親嗜性等。M蛋白是構成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前體是由膜外區(qū)、信號肽、極性區(qū)、跨膜區(qū)突于病毒粒子內C-端區(qū)等功能區(qū)域構成，分子質量為29～31ku；M蛋白不僅決定了病毒粒子的出芽位點和裝配位點，也可以影響病毒變異。N蛋白是一種酸性蛋白質，分子量為47KDa，含有382個氨基酸殘基，該蛋白不僅是豬傳染性胃腸炎病毒的結構蛋白，同時對病毒基因組的加工、復制都具有重要作用。sM蛋白分子質量為78ku，含有1種小膜蛋白和82個氨基酸殘基，該功能蛋白在抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的體液和細胞免疫中具有重要作用。
3 分子生物學檢測方法
3.1 核酸探針 核酸探針檢測方法的基本原理是利用核苷酸堿基互補，在堿基互補過程中，采用標記物標記與被檢測靶序列互補的單鏈核酸分子，進而檢測到目的核序列。該檢測方法與掃描電鏡、熒光抗體試驗、病毒分離等相比，具有較好的特異性，并且可以實現(xiàn)快速檢測的目的?，F(xiàn)代研究表明[6]，不同的病毒探針可以分別擴增出與其對應的病毒模板，對其他病毒模板影響不大，同時核酸探針擴增的最低檢測限為3 000～6 000個拷貝的單個病毒核酸，具有較高的特異性和敏感性。
3.2 普通RT-PCR方法 該檢測方法使用的首要條件是知道被檢測病原的相關目的基因序列，根據(jù)相關目的序列后，采用相關軟件設計相應的引物，然后進行體外擴增目的基因，進而達到檢測的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法檢測豬傳染性胃腸炎病毒，并采用相同濃度做重復性檢測，結果顯示RT-PCR擴增的特異性條帶為590bp左右；然后又以豬瘟病毒、豬細小病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病病毒以及豬輪狀病毒做特異性試驗，結果顯示僅有豬傳染性胃腸炎病毒得到了特異性目的條帶，所以RT-PCR檢測方法對豬傳染性胃腸炎病毒檢測具有較好的重復性和特異性。
3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR檢測方法是以普通PCR為基礎發(fā)展的一種新型檢測方法，該檢測方法可以在一個PCR反應體系中加入多對引物，并通過采用優(yōu)化后的PCR反應條件，達到同時檢測多種病原的目的，具有快速、成本低等優(yōu)點，目前也常用于各種疾病的診斷?；艚鹨萚8]建立了多重RT-PCR法檢測傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、嵴病毒和A群輪狀病毒的方法，并對該檢測方法進行了敏感性試驗和特異性試驗，結果顯示，多重RT-PCR法可以檢測出50TCID50的混合病毒，且能擴增出長度為275bp、544bp、750bp的3條特異性片段，具有較高的特異性和敏感性，可以在臨床上推廣使用。
3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要設計內、外2對引物，并通過2次擴增對樣品進行檢測，該方法相對其他PCR檢測方法，具有較高的敏感性，且節(jié)約成本?，F(xiàn)代研究表明，PCR技術在檢測病毒時，可以省略不同病毒分離的過程，具有較高的敏感性和特異性，而套式PCR方法在病毒粒子較少的情況下依然能夠檢測出，表明套式PCR比常規(guī)PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR檢測豬呼吸道冠狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的S基因序列，根據(jù)兩組病毒的基因序列分別設計了2對引物，然后分別以豬呼吸道冠狀病毒細胞和豬傳染性胃腸炎病毒細胞為模板進行套式PCR特異性片段擴增，結果顯示，豬呼吸道冠狀病毒擴增的基因片段為214bp，豬傳染性胃腸炎病毒擴增的基因片段為886bp，同時檢測出了這種病毒，具有較高的特異性和敏感性。
3.5 熒光定量RT-PCR方法 熒光定量RT-PCR檢測方法的原理是在PCR反應體系中采用熒光探針標記法或加入了SYBR GreenI熒光染料標記PCR的反應產物，然后使用反應儀器收集反應產物的熒光信號，并根據(jù)熒光信號的強弱確定產物的量，進而達到與起始模板準確定量的目的。該檢測方法與常規(guī)RT-PCR相比，不需要進行電泳試驗檢測PCR反應產物，反應結果更為直觀、方便，同時又避免了因電泳試驗對環(huán)境造成污染。王建中等[10]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病病毒的S基因序列設計了引物，并通過多組試驗對熒光定量RT-PCR反應條件進行優(yōu)化，結果顯示，優(yōu)化后的檢測方法對其他病原的檢測結果均為陰性，檢測結果的敏感性高達43.07拷貝/μL，是常規(guī)PCR檢測方法的100倍，具有較高的敏感性和特異性。
3.6 環(huán)介導等溫擴增技術 環(huán)介導等溫擴增技術是近幾年新興的一種分子生物學檢測方法，因其具有特異性強、敏感性高、檢測速度以及操作簡單等優(yōu)點，目前已經廣泛應用于病毒病和細菌病檢測。高睿澤等[11]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒的N基因建立了環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法，并對該檢測方法的敏感性和特異性進行了評價，結果顯示，該方法在63℃下可以使豬傳染性胃腸炎病毒N基因獲得較高的特異性擴增，且與豬流行性腹瀉病毒等物交叉反應，具有加高的特異性；同時該檢測方法可以檢測到131.4fg/μL的DNA，其靈敏度比常規(guī)PCR高出3個數(shù)量級。
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