時間：2023-09-18 17:04:09
序論：在您撰寫基因治療的基本策略時，參考他人的優(yōu)秀作品可以開闊視野，小編為您整理的7篇范文，希望這些建議能夠激發(fā)您的創(chuàng)作熱情，引導(dǎo)您走向新的創(chuàng)作高度。
關(guān)鍵詞：硝苯地平；不良反應(yīng)；牙齦增生
目前鈣離子通道拮抗劑作為治療高血壓、緩解心絞痛的常用藥，以其價格低廉、療效顯著及相對安全，在臨床中被廣泛應(yīng)用。其常見的不良反應(yīng)如：低血壓、心動過速、顏面潮紅、外周水腫、充血性心衰等，而近年來一些少見不良反應(yīng)，尤其是該類藥物導(dǎo)致牙齦增生的報道相繼出現(xiàn)，逐漸引起臨床醫(yī)生的重視[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在鈣離子拮抗劑中，硝苯地平所致牙齦增生最為常見。本文就臨床觀察到的1例服用硝苯地平后出現(xiàn)牙齦增生的病例進行探討。
1 資料與方法
1.1一般資料 將我院2015年3月接收1例服用硝苯地平患者出現(xiàn)牙齲增生者作為調(diào)查對象，馮某，男，44歲，高血壓病10余年，最高血壓170/120 mmHg，服用硝苯地平10 mg，1次/ d 3年余，查體：一般情況可，血壓110/90 mmHg，心率70次/min，雙側(cè)牙齦增生，心肺腹查體陰性，雙下肢對稱性指凹性水腫。診斷：高血壓病3級（極高危）鈣離子拮抗劑所致雙下肢水腫及牙齦增生，見圖1。
圖1 牙齦增生
1.2方法 停用硝苯地平，更換降壓藥為替米沙坦40 mg Qd美托洛爾23.75 mg Qd及短期應(yīng)用利尿劑。
2 討論
硝苯地平引起牙齦增生的發(fā)病率，國外文獻報道為14%～83%，國內(nèi)有文獻報道為20.8%，通常表現(xiàn)為牙齦邊緣和牙齦增生，質(zhì)地堅韌、略有彈性，無痛，一般不出血，但多數(shù)患者會伴有牙齦炎癥，出現(xiàn)牙齦出血、松軟和顏色的改變[2]。
目前，硝苯地平致牙齦增生發(fā)病的分子及細胞學(xué)機制尚不十分明確，主要與膠原代謝紊亂、激素、炎癥與免疫反應(yīng)等有關(guān)，且其發(fā)病可能與多種易感因素有關(guān)，如遺傳因素、個體易感性、用藥劑量、療程、菌斑指數(shù)及牙齦炎癥、性別、年齡等，其中研究發(fā)現(xiàn)，不同人群對硝苯地平的反應(yīng)不同，發(fā)生牙齦增生亦因人而異，即可能分為硝苯地平牙齦敏感型及硝苯地平牙齦耐受型，且用藥劑量越大、用藥療程越長，其發(fā)生率越高，病變越重。亦有研究發(fā)現(xiàn)，口腔衛(wèi)生條件差、菌斑指數(shù)高可加重牙齦炎癥，是引起牙齦增生的獨立危險因素，一般男性的發(fā)病率高于女性，大致為女性的3倍，考慮可能與硝苯地平阻止鈣離子內(nèi)流，使細胞外鈣離子堆積，刺激局部雄性激素的代謝，從而促進成纖維細胞的增殖或使膠原酶釋放減少有關(guān)，另有研究提示其發(fā)病率與年齡呈負相關(guān)，年齡越小發(fā)病率越高，隨著年齡增長，其發(fā)病率降低[3-6]。
藥物性牙齦增生的治療，首先是停用可能有影響的藥物，最好更換為其他類型降壓藥，大多數(shù)患者停藥后數(shù)月內(nèi)可自行緩解，對血壓控制不好，無法停藥的患者，最好采用聯(lián)合用藥，減少單藥用藥劑量，也能一定程度減少其發(fā)病率。對于一些中重度牙齦增生，還可就診于口腔科，行牙周治療，如菌斑控制、齦上潔治和齦下刮治、根面平整等，對于嚴重牙齦增生的患者還可行手術(shù)切除，然而該治療僅為短暫緩解，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，尤其是對于未停藥、口腔衛(wèi)生條件差或缺乏口腔護理的患者，因此保持良好的口腔衛(wèi)生、定期行專業(yè)的口腔清潔、控制牙菌斑亦為重要的治療方案[7-10]。
綜上，藥物性牙齦增生不僅影響咀嚼功能，同時會影響美觀、加重牙齦炎癥、產(chǎn)生口腔異味等，也有研究發(fā)現(xiàn)牙周疾病的慢性感染過程能夠影響心血管系統(tǒng)，最終將形成惡性循環(huán)，不利于高血壓與冠心病的治療，故這一問題應(yīng)該引起臨床醫(yī)生的重視，深入研究其發(fā)病機制，尋找更多更有效的治療方案。
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關(guān)鍵詞：基本醫(yī)療 醫(yī)保費用 增長 控制
目前我國基本醫(yī)療保險已經(jīng)覆蓋12.95億人，覆蓋95%以上人口。隨著我國醫(yī)療衛(wèi)生體制的改革，覆蓋面已經(jīng)基本涵蓋了城鎮(zhèn)居民、農(nóng)民及外出打工人群。人們在享受醫(yī)療保險帶給我們醫(yī)療保障的同時，醫(yī)療費用的快速上漲，也給醫(yī)?；饚砹顺林氐呢摀?dān)。因此，若何有效控制醫(yī)療保險費用的過快增長，是醫(yī)療保險制度健康、有序、穩(wěn)步發(fā)展的前提，是保障人民群眾健康的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時，也是醫(yī)療保險事業(yè)平穩(wěn)運行的基石。本文結(jié)合醫(yī)療保險管理的實際，對我國醫(yī)療保險運行機構(gòu)如何控制醫(yī)療保險費用的過快增長進行分析和探討。
一、醫(yī)療費用過快增長的原因分析
引起次均醫(yī)療費用和就醫(yī)頻率增加的因素很多，從對部分省份醫(yī)療基金運行的實際情況分析，主要影響因素包括以下方面：
（一）正常醫(yī)療需求的增加。
一方面，基本醫(yī)療保險制度從無到有，居民生活水平不斷提高，使人們的醫(yī)療需求得以正常釋放，直接影響到了就醫(yī)頻率的增加。同時，2009年開始，各統(tǒng)籌地區(qū)為了合理控制醫(yī)療保險統(tǒng)籌基金的結(jié)余規(guī)模，分階段、不同程度地對本統(tǒng)籌地區(qū)醫(yī)療保險待遇政策進行了調(diào)整。例如：提高醫(yī)療保險統(tǒng)籌基金年度最高支付限額和共付段醫(yī)?；鹬Ц侗壤?、增設(shè)門診大病病種等。在降低參保人員個人負擔(dān)的同時，提升了參保人員的就醫(yī)意愿，從而影響到了就醫(yī)頻率的增加。
另一方面，我國城鎮(zhèn)職工參保人群年齡結(jié)構(gòu)處于一個逐漸老化的趨勢中，各種慢性疾病、危重病發(fā)生概率增加，直接導(dǎo)致就醫(yī)頻率和次均費用的增加。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，退休人員的次均門診費用與在職人員差別不大，次均住院費用、門診就診率和住院率卻差別明顯。
（二）以量補價的過度醫(yī)療現(xiàn)象普遍存在，推動醫(yī)療費用大幅增加。
受國家價格政策因素的影響，醫(yī)療機構(gòu)通過提高醫(yī)療收費項目價格的創(chuàng)收途徑受到制約，同時又由于我國絕大部分統(tǒng)籌地區(qū)均采用項目付費的結(jié)算方式，刺激了各醫(yī)療機構(gòu)通過增加醫(yī)療服務(wù)提供量和種類來創(chuàng)收。以量補價的過度醫(yī)療情況已成為我國醫(yī)療費用不合理支出快速增加的重要原因。
（三）先進醫(yī)療技術(shù)在臨床推廣，對高級別醫(yī)院的次均費用影響較大。
隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，新的醫(yī)療儀器設(shè)備、藥品和診療技術(shù)層出不窮，極大地提高了診療水平，在解決疑難雜癥方面起到了重要作用。與此同時，醫(yī)療技術(shù)的進步，其本身的高科技價值也帶來了醫(yī)療費用的攀升。
二、控制醫(yī)療費用上漲的應(yīng)對措施
醫(yī)療衛(wèi)生資源的有限性與醫(yī)療服務(wù)需求的不斷膨脹之間的矛盾，醫(yī)療保險籌資與支出之間的矛盾，醫(yī)療保險支出與積累之間的矛盾，是關(guān)系到社會保險事業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。根據(jù)醫(yī)療費用上漲的特點，在保障醫(yī)療需求合理增加的前提下，結(jié)合電力行業(yè)實際，應(yīng)從以下幾方面采取措施，控制醫(yī)療費用的快速上漲。
（一）加大醫(yī)保政策宣傳力度。
我國現(xiàn)行的是“低水平、廣覆蓋、保基本”的醫(yī)療保障制度和“以收定支、收支平衡、略有結(jié)余”的基金管理原則。醫(yī)保部門應(yīng)加強醫(yī)保政策的宣傳，使參保人員明白基本醫(yī)療保險保的是基本醫(yī)療，而不是特需醫(yī)療?；踞t(yī)療就是因病施治，進行合理的檢查、用藥及治療。不根據(jù)病情需要，盲目要求醫(yī)生多開藥、開貴藥，不僅不能對癥治療，還會給自己和醫(yī)保基金造成浪費。
（二）加強政策引導(dǎo)，合理分流病人。
建立雙向轉(zhuǎn)診制度，合理分流參保人員到適合自身疾病治療的相應(yīng)級別醫(yī)院就醫(yī)。為促使雙向就診制度的有效實施，醫(yī)療保險經(jīng)辦機構(gòu)應(yīng)積極主動延伸服務(wù)，一方面將各定點醫(yī)療機構(gòu)收治的各類常見病的治愈率、次均醫(yī)療費用、平均住院天數(shù)、個人負擔(dān)、病人滿意度等多種信息定期對外公布；另一方面，對我國醫(yī)技高超、醫(yī)德高尚的醫(yī)務(wù)工作者，醫(yī)療保險經(jīng)辦機構(gòu)可以主動進行宣傳，盡量減少病人和醫(yī)院之間的信息不對稱程度。
（三）實施醫(yī)療保險定點醫(yī)生管理制度，強化醫(yī)務(wù)人員的自律性。
隨著我國五險合一的金保工程二期信息系統(tǒng)在部分地區(qū)范圍內(nèi)逐步推廣使用，對醫(yī)療保險定點醫(yī)療機構(gòu)精確化管理程度提高，管理落實到醫(yī)生的條件已基本成熟?？梢越⒉糠值貐^(qū)醫(yī)療保險定點醫(yī)生庫，制定定點醫(yī)生誠信評判標準和激勵機制，建議全國各省份人力資源和社會保障管理部門將醫(yī)保定點醫(yī)生的誠信狀況作為醫(yī)生職稱評定的標準之一，提升醫(yī)生提供醫(yī)療服務(wù)的自律性。
（四）加強醫(yī)?；斯芾恚_?；鸢踩?/p>
加強醫(yī)?；斯芾?，加大對違規(guī)行為的查處力度，對參保人員將醫(yī)療卡、證轉(zhuǎn)借他人使用，惡意騙取醫(yī)保基金等各種違規(guī)行為，要加大查處打擊力度，以此強化就醫(yī)管理，促使參保人員規(guī)范就醫(yī)行為。如：把醫(yī)?；俗鳛獒t(yī)保工作重心之一，通過加強對監(jiān)管，有效遏制分解住院、降低入院標準、掛床、冒名住院、虛擬住院、過度治療等不規(guī)范醫(yī)療服務(wù)行為，促進醫(yī)療服務(wù)質(zhì)量的提高，維護參保人的權(quán)益。
（五）完善醫(yī)療保險定點醫(yī)療機構(gòu)管理質(zhì)量評價機制，實施定點醫(yī)療機構(gòu)分級管理。
通過實施定點醫(yī)療機構(gòu)分級管理，進一步改進定點醫(yī)療機構(gòu)年度考核指標，并建立定點醫(yī)療機構(gòu)管理激勵和約束機制，變被動管理為主動管理。
雖然腫瘤的基因治療在整個基因治療的臨床方案中占63％以上，但迄今為止在臨床上仍無重大突破。這是由于基因治療缺乏靶向性，基因的轉(zhuǎn)染率和表達量都很低。同樣用病毒治療惡性腫瘤也成為研究的熱點，如腺病毒ONYX－015、CV706，雖然也取得了某些進展，但沒有重大突破，其原因是病毒治療雖有靶向性，轉(zhuǎn)染率也不低，但殺傷率較小。為此，我們提出癌癥的靶向基因一病毒治療策略，即以溶瘤病毒作為基因的表達載體(所謂溶瘤病毒即病毒只特異性地在腫瘤中復(fù)制而在正常細胞中不復(fù)制)，將溶瘤病毒治療與基因治療各自的優(yōu)勢相結(jié)合。其療效既比單用基因治療好，也比單用病毒治療好，是今后基因治療與病毒治療的新趨勢。目前，圍繞此策略開展的一系列研究工作，正在不斷深入之中。
癌癥的靶向基因――病毒治療
這一策略的基本方法是：將腫瘤特異性增殖病毒(溶瘤病毒)作為載體，在其中插入抗癌基因。我們使用的是經(jīng)過改造的腺病毒載體，它可特異性地導(dǎo)向腫瘤，本身就有一點治療作用，而且可特異性地在腫瘤中復(fù)制數(shù)百至數(shù)千倍，使所攜帶的基因也能特異性地在腫瘤中增殖數(shù)百至數(shù)千倍。
【關(guān)鍵詞】口腔鱗狀細胞癌；腫瘤；免疫基因治療；綜述
【中圖分類號】R739.8 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）03-0456-01
1 口腔鱗狀細胞癌簡介
口腔鱗狀細胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其好發(fā)部位依次為舌、牙齦、頰、腭、唇、口底。鱗狀細胞癌以角化珠形成及出現(xiàn)細胞間橋為病理學(xué)特征。腫瘤來自表面口腔黏膜上皮，腫瘤性上皮團或上皮島浸潤下方結(jié)締組織，細胞特征可表現(xiàn)為豐富的嗜酸性胞質(zhì)，胞核、核漿比大，程度不同的細胞及胞核的多形性，鱗狀上皮形成的角化珠和單細胞的角化均可見。OSCC占口腔頜面部癌瘤80%以上，患者5年生存率約為50%，對于腫瘤晚期和復(fù)發(fā)患者，生存率更低[1]。因此尋找有效的治療方法十分重要。經(jīng)過過去幾十年的發(fā)展，手術(shù)、放療及化療并沒有顯著提高口腔癌患者的生存率，化療藥物有明顯的副作用，而且對復(fù)發(fā)的口腔癌患者生存率的影響尚不明確。研究新的治療方法顯得尤為關(guān)鍵。
許多研究表明：惡性腫瘤的治療中，免疫治療一直走在前沿，口腔癌患者特別是鱗癌患者，其細胞免疫功能早期就不同程度地受到傷害，再加上常規(guī)治療方法（手術(shù)、放療、化療等）又可導(dǎo)致機體免疫功能的進一步下降。因此，口腔癌腫的最佳治療策略應(yīng)是包括免疫治療在內(nèi)的綜合療法。隨著人類基因組計劃的完成和口腔鱗癌發(fā)病功能基因的不斷探明，腫瘤基因治療這一生物治療手段越來越受到大家的認可。自從1988年Rosenberg[2]提出要將腫瘤免疫基因治療原理實際應(yīng)用于臨床起，學(xué)者們就對腫瘤的免疫基因療法展開了深入的研究。
2腫瘤免疫基因治療的概念
廣義的腫瘤基因治療概念認為，凡是能夠改變腫瘤細胞或其他體細胞的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能，而達到治療腫瘤目的的方法均屬于腫瘤基因治療的范疇。為區(qū)別傳統(tǒng)的化療及放療導(dǎo)致的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能（核酸）變化，將腫瘤基因治療定義為：以適當(dāng)?shù)幕蜣D(zhuǎn)移技術(shù)將特定的外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入腫瘤細胞或患者體內(nèi)，通過外源遺傳物質(zhì)的表達產(chǎn)物或?qū)λ拗骷毎旧磉z傳物質(zhì)表達的影響，直接或間接地殺傷或抑制腫瘤細胞[3]。從基因操作角度看，基因治療主要有四種方法，及基因修正、基因置換、基因失活和基因修飾。近年來，免疫基因療法在腫瘤的治療中得到廣泛應(yīng)用。
腫瘤免疫基因治療是依賴于機體免疫功能的間接殺傷。腫瘤免疫基因治療的定義為：根據(jù)免疫學(xué)的理論論技術(shù)建立的、以基因轉(zhuǎn)移技術(shù)為基礎(chǔ)的、以激發(fā)機體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細胞功能為目的的基因治療方法。免疫基因治療的發(fā)展反映了整個腫瘤基因治療歷史，首例得到美國FDA批準的腫瘤基因治療的臨床計劃是由Rosenberg[4]提出，用細胞因子基因體外轉(zhuǎn)導(dǎo)修飾TIL，最后回輸患者體內(nèi)，治療晚期惡性腫瘤病人。
3免疫基因治療的方法
基因治療在口腔鱗癌中的治療前景包括用于治療口腔鱗癌的復(fù)發(fā)和輔助治療，例如作為外科手術(shù)后的輔助措施；發(fā)生局部遠處轉(zhuǎn)移的口腔癌患者也是基因治療的應(yīng)用方向之一。盡管全身用藥理論上可以到達轉(zhuǎn)移的病灶，但是基因治療不適宜于全身輸送。因為大多數(shù)原發(fā)和復(fù)發(fā)病灶是很表淺的，因此口腔癌患者非常適宜局部直接注射治療。目前研究的用于治療口腔鱗癌的方法包括：1）添加抑癌基因-基因添加療法；2） 去除缺陷腫瘤基因-基因去除療法；3） 減少刺激腫瘤生長的基因的表達-反義RNA；4） 增強免疫監(jiān)測-免疫療法；5） 前體藥物活化起到化療效應(yīng)-自殺基因療法；6） 病毒破壞腫瘤細胞的復(fù)制周期；7）呈送抗藥基因給正常組織以防止化療損傷。
4口腔癌癌基因的研究
迄今人們已在脊椎動物細胞中確定了32種與逆轉(zhuǎn)錄病毒癌基因同源的細胞癌基因，其中20多種與腫瘤發(fā)生有關(guān)。研究口腔癌癌基因的表達以及癌基因產(chǎn)物的形成，對從分子水平認識口腔癌的發(fā)病機制和生物學(xué)行為具有重要意義。Hoellering[5]等采用生物素化的H-ras，cDNA探針原位雜交技術(shù)和免疫組化技術(shù)，對5例口腔癌患者腫瘤組織中H-ras癌基因的mRNA及其產(chǎn)物P2蛋白進行定位研究，發(fā)現(xiàn)H-ras癌基因與mRNA的分布可能與口腔癌的生長方式及預(yù)后有關(guān)。且發(fā)現(xiàn)晚期口腔癌組織中均有ras和myc家族癌基因的擴增。在口腔鱗癌中，c-myc表達量較正常組高2～5倍，平均水平為0.34±0.16pg /μg，其它與口腔腫瘤有關(guān)的癌基因還有c-erb-B2、fes、mos、myb等，其中ab1基因在口腔上皮癌細胞株的表達與其脫壁生長特征有關(guān)。進一步研究口腔腫瘤中癌基因的各種變化，無疑對揭示口腔腫瘤的發(fā)生機制和指導(dǎo)免疫基因治療具有重要意義。
5 口腔鱗癌的免疫基因療法
免疫基因療法治療口腔癌有兩種途徑：一是增強腫瘤細胞的致免性，一是提高患者對腫瘤的免疫反應(yīng)性。研究表明頭頸部鱗癌患者有數(shù)種免疫細胞功能缺陷，包括自然殺傷細胞、T細胞、以及一些細胞因子。盡管口腔癌沒有經(jīng)典的免疫性，但是很多證據(jù)表明其具有免疫識別功能。已進行的動物研究包括給予IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生LAK細胞、TNF- A，將 IL- 2、IL- 4、IFN- C、IL-6或IL-1B轉(zhuǎn)入腫瘤起到免疫調(diào)節(jié)作用聯(lián)合應(yīng)用非病毒脂質(zhì)體表達的鼠白介素 2和多聚體表達的mIL- 12治療口腔鱗癌，試驗證明是可行并有效的[6]。mIL-2和mIL-12聯(lián)合運用產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效應(yīng)可能是由于其刺激增強了Tc細胞和NK的活性。此外，最新研究表明，應(yīng)用缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠?qū)NF-α基因?qū)肟谇击[癌DNL中，帶有TNF-α基因的DNL能夠分泌高活性的TNF-α，表明口腔鱗癌DNL可作為基因轉(zhuǎn)移的運載細胞用于口腔鱗癌的細胞因子基因治療。
5.1 細胞因子與免疫基因治療
在當(dāng)前所開展的基因治療研究中，免疫基因治療的研究多集中于細胞因子基因治療的研究。細胞因子的基因治療避免了以往細胞因子注射療法需反復(fù)多次給患者或動物模型注射大劑量細胞因子所帶來的不良反應(yīng)，也取得了細胞因子注射療法所不具備的治療效果。細胞因子基因治療所選用的目的基因是可以編碼表達包括ILs、IFNs、CSFs及TNFs等在內(nèi)的各種細胞因子及其受體的基因[7]。依據(jù)將細胞因子基因?qū)塍w內(nèi)的途徑和原理不同，細胞因子基因治療可分為以下幾類：（1）以免疫效應(yīng)細胞為基礎(chǔ)的細胞因子基因治療；（2）以瘤苗為基礎(chǔ)的細胞因子基因治療；（3）以抗原呈遞細胞為基礎(chǔ)的細胞因子基因治療；（4）成纖維細胞等受體細胞為基礎(chǔ)的細胞因子基因治療；（5）直接體內(nèi)注射途徑的細胞因子基因治療。
5.2 抗體與免疫基因治療[8]
（1）抗體增強免疫基因治療的靶向性：解決免疫效應(yīng)細胞識別腫瘤細胞的特異性是腫瘤治療的關(guān)鍵之一，研究表明將腫瘤特異性單鏈抗體基因?qū)隩細胞中，使之分泌抗體，一方面通過抗體殺傷腫瘤細胞；另一方面通過抗體使特異性結(jié)合增加。
（2）抗體作為免疫基因治療的效應(yīng)分子：胞內(nèi)抗體可用于腫瘤治療。美國學(xué)者構(gòu)建了一種編碼單鏈抗體的載體（PGT21），將此載體轉(zhuǎn)入高表達erbB2的卵巢癌細胞株SKOV3細胞中，可以通過胞內(nèi)表達抗體erbB2單鏈抗體，抑制瘤細胞的生長。
（3）抗原與免疫基因治療：在腫瘤治療方面，經(jīng)FDA批準，已有學(xué)者將編碼CEA、Ig基因表達載體直接導(dǎo)入結(jié)腸癌和口腔鱗癌患者體內(nèi)，臨床顯示其有一定抗腫瘤效應(yīng)。
5.3 綜合性免疫基因治療
有研究表明，單一途徑的免疫基因治療效果并不理想，因此，將相互間有相加或協(xié)同效應(yīng)的不同方法聯(lián)合起來治療口腔鱗癌的臨床效應(yīng)值得嘗試。目前主要的研究方向有：細胞因子基因治療與細胞因子基因治療的聯(lián)合；細胞因子基因治療與B7等共刺激分子基因治療聯(lián)合；細胞因子基因治療與MHC基因治療聯(lián)合；④細胞因子基因治療與抗原基因治療聯(lián)合；⑤細胞因子基因治療與自殺基因聯(lián)合治療。
6展望
綜上所述，口腔頜面鱗癌免疫基因療法發(fā)展至今，經(jīng)歷了從單一途徑療法轉(zhuǎn)向多途徑聯(lián)合治療的階段，進一步提高了臨床療效。伴隨著新的免疫基因療法的不斷問世，基因聯(lián)合療法的治療效果更加明顯，且不良反應(yīng)也大大降低。同時，結(jié)合口腔鱗癌術(shù)前術(shù)后輔助療法是可行的治療方式，并有望進一步提高生存率。比較同期不同心的聯(lián)合基因療法的隨機試驗仍在進行中，這些試驗將可能為治療口腔頜面部鱗癌患者治療中的作用確立1個新的位置。另外口腔鱗癌往往伴有第二原發(fā)腫瘤的風(fēng)險，已經(jīng)成為影響患者長期生存率的重要因素之一。免疫基因療法對于第二原發(fā)腫瘤的影響如何，有待進一步研究。
免疫基因治療是一種新興的治療腫瘤的方法。隨著腫瘤分子生物化學(xué)研究的不斷深入，我們能夠拓展基因治療腫瘤的方法，選擇性針對腫瘤細胞。由于口腔鱗癌基因突變頻繁，位置表淺易于瘤內(nèi)給藥，因此基因治療適合運用于口腔鱗癌?；虔煼ㄓ糜冖衿诘念^頸部鱗癌是安全有效的；對于Ⅱ期鱗癌，聯(lián)合放療或化療，也能起到抗瘤效應(yīng)；作為輔助措施治療Ⅲ期鱗癌的正在進一步研究中。以后的研究方向在于建立起安全有效的利用免疫基因療法治療口腔鱗癌的方法體系。
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【中圖分類號】 R734.2【文獻標識碼】 B【文章編號】 1007-8517(2009)24-0100-01
肺癌是常見的惡性腫瘤之一,目前治療是以手術(shù)、化療、放療為主,聯(lián)合生物治療、中醫(yī)中藥治療等的綜合治療模式,但隨著腫瘤分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,肺癌生物治療不斷被賦予新的內(nèi)容,治療方法逐漸擴展到基因治療、免疫治療以及近年來興起的分子靶向治療[1],為肺癌治療開辟了更為廣闊的前景。本文就肺癌生物治療的現(xiàn)狀及研究進展綜述如下。
1 肺癌生物治療現(xiàn)狀
生物治療的原理是通過為腫瘤患者補充具有殺死、抑制腫瘤能力的免疫細胞和能力,調(diào)節(jié)患者自身免疫功能,達到控制和清除腫瘤細胞的目的,主要包括細胞因子技術(shù)、基因治療技術(shù)、腫瘤疫苗技術(shù)、免疫活性細胞繼承性輸注技術(shù)、單克隆抗體及其耦聯(lián)物技術(shù)等[2],彼此之間并沒有明確的界限,它們的出現(xiàn)標志著腫瘤生物治療體系的基本形成,雖然途徑與方法各異,但目的都是通過最大限度的利用人體自身所具有的抗腫瘤能力來治療惡性腫瘤。生物治療有自己獨特的優(yōu)點,毒副反應(yīng)較低.僅在高劑量時有低血壓、發(fā)熱皮疹、抗原抗體反應(yīng)等,發(fā)生率較低[3],臨床上治療肺癌應(yīng)用最多的為細胞因子,免疫調(diào)節(jié)劑、基因治療和分子靶向治療藥物也已應(yīng)用于臨床,過繼免疫細胞中淋巴活化殺傷細胞(LAK)已見報告,為今后生物治療的發(fā)展研究提供了豐富的內(nèi)容。
2 肺癌生物治療研究進展
2.1 分子靶向治療腫瘤分子靶向治療是利用分子靶向藥物特異性,以腫瘤組織或腫瘤細胞中所具有的特異性分子為靶點,阻斷該靶點的生物學(xué)功能,或選擇性從分子水平來逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為,從而達到抑制腫瘤生長甚至腫瘤消退的目的[4]。其中以表皮生長因子受體(EGFR)和腫瘤血管生成作為靶點的藥物占60%,以表皮生長因子受體作為靶點的治療藥物包括吉非替尼、埃羅替尼、西妥昔單抗等,以腫瘤血管生成作為靶點的治療藥物包括貝伐單抗、ZD647、內(nèi)皮抑素、基質(zhì)金屬蛋白酶等,其它靶向治療藥物如基質(zhì)金屬蛋白激酶(MMPs)抑制劑、血管生成因子抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)化酶抑制劑(FTIs)、環(huán)氧化酶抑制劑、組氨酸脫乙?；敢种苿┑确肿影邢蛐运幬镎谶M行臨床前或臨床試驗研究中[5]。
2.2 細胞因子治療 常用于肺癌的細胞因子有干擾素(IFN)、白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、紅細胞生成素(EPO)和集落刺激因子(CSF)等。細胞因子的應(yīng)用是目前最成熟的生物治療方法,尤其是IFN和IL,目前已經(jīng)在肺癌治療中應(yīng)用非常成熟,CSF、TNF、EPO等也逐漸被廣泛應(yīng)用,在腫瘤的治療中起到了重要作用。IFN是最早發(fā)現(xiàn)具有抗癌效應(yīng)的細胞因子,早在1980年第一次用于小細胞肺癌(SCLC)的實驗中就顯示出了良好的前景。IL一24是近來發(fā)現(xiàn)的一種新白介素,利用腺病毒轉(zhuǎn)染的方法發(fā)現(xiàn)其可以抑制肺癌細胞的增殖并可以增強肺癌細胞對放療的敏感性。CSF及EPO的應(yīng)用對于克服骨髓抑制、預(yù)防傳統(tǒng)放化療所產(chǎn)生的白細胞下降及紅細胞減少無疑起到了保駕護航的作用,為提高放化療藥物的使用劑量從而達到更好的治療效果起到了關(guān)鍵作用[6]。
2.3 免疫治療 主要包括腫瘤疫苗、過繼性免疫治療及補充細胞因子,其中發(fā)展最快的是腫瘤疫苗。目前應(yīng)用的肺癌疫苗有腫瘤細胞疫苗、胚胎抗原疫苗、病毒疫苗、癌基因產(chǎn)物疫苗、人工合成多肽疫苗、抗獨特型疫苗和樹突狀細胞疫苗等,樹突狀細胞疫苗能形成強有力的特異性細胞免疫應(yīng)答,有效地清除血源性播散的肺癌細胞,發(fā)展最為矚目[7],Ueda等應(yīng)用CEA652體外沖擊致敏樹突細胞,治療CEA陽性的肺腺癌患者,發(fā)現(xiàn)治療后患者病情穩(wěn)定,血清中CEA水平明顯降低。受到重視的還有第3代疫苗:核酸疫苗,包括DNA疫苗和RNA疫苗, DNA疫苗在體內(nèi)可持續(xù)高表達相應(yīng)抗原,被樹突細胞攝取并致敏后,激發(fā)高效的細胞和體液免疫反應(yīng),是最有潛力的腫瘤疫苗發(fā)展方向。
2.4 基因治療
2.4.1p53基因治療 在基因治療研究中,以腺病毒轉(zhuǎn)染抑癌基因p53的表達研究較為成功。國外對重組腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療NSCLC的臨床研究已基本完成,結(jié)果顯示腺病毒p53注射液在NSCLC中有抗瘤活性。一項研究中,對12例氣道阻塞且無法手術(shù)的肺癌患者瘤內(nèi)注射重組腺病毒p53注射液106―1011pfu,28天重復(fù)一次,其中6例患者癥狀得到緩解。然而也有研究者將重組腺病毒p53注射液聯(lián)合化療治療NSClC,發(fā)現(xiàn)兩組療效和生存期無顯著差異。
2.4.2 殺傷基因?qū)⒕哂袣饔玫幕蚱螌?dǎo)入細胞復(fù)制的DNA序列中,從而打斷細胞基因的連續(xù)性,抑制基因的過量表達和腫瘤細胞的增殖。自殺基因和凋亡基因通過引發(fā)腫瘤細胞的凋亡而起到殺傷腫瘤細胞的作用。TK基因-GCV系統(tǒng)是最有希望在臨床上用于腫瘤基因治療的方法之一,在肺癌基因治療中具有顯著作用。
2.4.3 RNAi技術(shù) 在針對腫瘤的基因治療策略中,RNAi技術(shù)以其自身的諸多優(yōu)勢,在不影響正?；蚬δ艿那疤嵯?可以針對在細胞癌變過程中發(fā)揮重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相關(guān)基因、血管生成因子及其受體以及部分關(guān)鍵酶等,抑制突變基因表達或基因的過量表達。如Zhang等用HER-1 siRNA抑制了肺癌細胞A549的EGFR的表達,使肺癌細胞比對照組細胞數(shù)減少了85%,EGFR蛋白表達下降了70%以上,對順鉑的敏感性增加了4倍。
3 展望
作為一種新的治療模式,生物治療目前還存在很多問題,如各種治療藥物的有效性、安全性還有待于進一步評價,是否有必要采用特異性檢測手段篩選分子靶向藥物的適應(yīng)人群來實現(xiàn)個體化用藥,及建立這類藥物與手術(shù)、放化療之間的最佳聯(lián)合方案還需不斷摸索。但我們深信在不久的將來,隨著對腫瘤生物學(xué)特性和行為了解的不斷加深、分子藥物研究的不斷發(fā)展,將會出現(xiàn)一批新型的低毒、高效靶向治療藥物,為肺癌乃至其他所有腫瘤患者帶來福音。
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【關(guān)鍵詞】 六味地黃丸/藥理學(xué) 肝腫瘤/中西醫(yī)結(jié)合療法 腫瘤/病理學(xué) 細胞凋亡 基因療法 自殺基因
疾病模型，動物； 小鼠
肝癌的基因治療，特別是自殺基因治療，在控制腫瘤的增殖、預(yù)防和延緩復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，以及提高病人生活質(zhì)量方面具有獨特的優(yōu)勢，成為肝癌治療活躍的研究領(lǐng)域［1-3］。從已有的研究結(jié)果來看，單純自殺基因治療仍難以達到完全根治腫瘤的目的。因此，尋找自殺基因療法的增效方法是目前各種腫瘤自殺基因治療的研究熱點之一。
免疫機制是旁觀者效應(yīng)產(chǎn)生的重要機制［4-5］，改善自殺基因療法作用的炎癥免疫微環(huán)境是自殺基因療法增效的主要途徑［6-7］。六味地黃丸具有增強機體免疫功能和直接抗腫瘤作用［8-13］，我們前期的研究結(jié)果顯示其對小鼠移植性肝癌HSVtk/GCV自殺基因治療具有增效作用［14］，本文旨在觀察其療效的病理學(xué)機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要試劑與儀器 細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、濾膜、凍存管等為美國Corning公司和丹麥NUNC公司產(chǎn)品；Polybrene和G418為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM、RPMI1640、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。主要儀器為BNA3210型CO2培養(yǎng)箱（日本ESPEC），億鳴200病理圖像分析系統(tǒng)（中國億鳴）等。
1.2 動物 昆明種小鼠，18～22g，雄性占2/3，雌性占1/3，健康，清潔級，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供（合格證號：2003A008）。
1.3 細胞株 病毒包裝細胞PT67購自美國Clontech公司，已于前期將重組pLXSNtk質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PT67細胞內(nèi)記為PT67/tk［15］；小鼠肝細胞癌細胞株H22購自中山大學(xué)實驗動物中心細胞庫。
1.4 藥物及配制 六味地黃丸為北京同仁堂產(chǎn)品（批號：4030098），于無菌室內(nèi)用消毒研缽加少許消毒蒸餾水研磨后，配成濃度為500g/L的藥液，小鼠給藥劑量為生藥10g·kg-1·d-1；丙氧鳥苷（GCV）為麗珠集團湖北科益藥業(yè)有限公司產(chǎn)品（批號：040701），于無菌室以注射用生理鹽水25mL溶解，濃度為10g/L，小鼠給藥劑量為100mg·kg-1·d-1。
1.5 小鼠肝細胞癌細胞株H22的感染及GCV體外殺傷效應(yīng)的觀察 復(fù)蘇包裝細胞PT67/tk，吸取其培養(yǎng)上清液，加入H22的培養(yǎng)液中，上清液病毒感染H22細胞后用G418(800mg/L)篩選，獲得抗性細胞克隆，命名為H22/tk，將H22/tk和野生型H22細胞分別以2×103、3×103、5×103個/孔接種96孔板，同時加入不同濃度的GCV使終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100mg/L，以不加GCV的細胞孔作對照，每一個濃度設(shè)4個復(fù)孔，于倒置顯微鏡下觀察殺傷效應(yīng)。
1.6 造模及治療
1.6.1 小鼠移植性肝癌的造模 將H22/tk和野生型H22按1：4混合（模擬臨床體內(nèi)病毒感染腫瘤細胞比率10%～20%）。混合后的細胞制備成1×1010個/L的細胞懸液，臺盼藍活細胞計數(shù)＞90%；按0.2mL/只（含2×106個腫瘤細胞）細胞懸液接種于小鼠的皮下。
1.6.2 分組及治療 昆明種小鼠90只，隨機分為5組：正常對照組、模型對照組、六味地黃丸治療組、自殺基因治療組、聯(lián)合治療組（自殺基因聯(lián)合六味地黃丸），正常對照組10只，其他組各20只。正常對照組右前肢腋下注射生理鹽水0.2mL，其他各組右前肢腋下接種肝癌細胞懸液0.2mL。正常對照組和模型對照組第2～16天蒸餾水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理鹽水每天0.25mL/只；六味地黃丸治療組第2～16天六味地黃丸懸液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理鹽水每天0.25mL/只；自殺基因治療組第2～16天蒸餾水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只；聯(lián)合治療組第2～16天六味地黃丸懸液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只。
1.7 療效觀察及病理學(xué)機制
1.7.1 腫瘤質(zhì)量及抑瘤率 實驗結(jié)束后處死動物，用眼科剪分離剝?nèi)∧[瘤，萬分之一電子天平稱質(zhì)量，記錄結(jié)果。計算抑瘤率［16］:p抑瘤/%=（mmodel－mtreatment）/mmodel×100%。
1.7.2 病理學(xué)觀察及半定量分析 腫瘤用體積分數(shù)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡觀察腫瘤細胞的密度、腫瘤壞死、間質(zhì)反應(yīng)，并采用盲法評分。腫瘤細胞密度：根據(jù)腫瘤細胞大小及密集程度分為+、++、+++3個等級。壞死分為+：灶狀壞死；++：網(wǎng)狀多灶狀壞死；+++：大片狀壞死。纖維結(jié)締組織根據(jù)腫瘤間質(zhì)內(nèi)及瘤周纖維的增生情況由低到高依次分為+、++、+++3個等級。腫瘤細胞核分裂像計數(shù)方法為每張HE染色切片隨機取5個非壞死區(qū)域高倍視野，對核分裂像進行計數(shù)。
1.7.3 增殖核抗原（PCNA）免疫組化染色及陽性細胞計數(shù) 采用免疫組化SP法。切片脫蠟至水，入體積分數(shù)1%過氧化氫溶液20min；磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，5min×3次；滴加封閉液，20min；滴加增殖核抗原抗體，37℃濕盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；滴加生物素標記二抗，30min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，60min；PBS漂洗，5min×4次；聯(lián)苯二胺(DAB)顯色，10min，Mayer蘇木素復(fù)染5s，干燥后中性樹膠封片。胞核呈棕黃色為陽性細胞，每張切片隨機取5個非壞死區(qū)域高倍視野，計數(shù)陽性細胞個數(shù)并取平均值。
1.7.4 腫瘤細胞凋亡的檢測 采用原位末端標記（TUNEL）法。切片脫蠟至水；蛋白酶K消化10min；PBS漂洗，5min×3次；滴加反應(yīng)液，37℃濕盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；加入體積分數(shù)0.3%的過氧化氫，20min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，30min；PBS漂洗，5min×3次；DAB染色10min，Mayer蘇木素復(fù)染，干燥后中性樹膠封片。以胸腺組織為陽性對照，不加末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作為陰性對照。細胞核呈棕黃色為陽性細胞，每片隨機選取5個非壞死區(qū)域高倍視野，計數(shù)陽性細胞的個數(shù)，以同一視野內(nèi)陽性細胞占總細胞的百分比表示細胞凋亡指數(shù)：p凋亡/%=(n陽性細胞/n總細胞）×100%。
1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析；等級資料采用Ridit分析。
2 結(jié)果
2.1 體外殺傷效應(yīng) 鋪板48h后，H22/tk100mg/L濃度孔中細胞開始死亡，表現(xiàn)為胞膜不完整，輪廓模糊，不透亮，形狀不規(guī)則，并且碎裂成小粒狀；10mg/L以下組僅見極少數(shù)細胞死亡，且增殖明顯。野生型H22細胞均呈現(xiàn)明顯的細胞增殖。72h后，H22/tk的GCV100mg/L以上濃度孔中絕大部分細胞碎裂成小粒狀，孔內(nèi)基本無活細胞生存；其他包括野生型H22細胞孔均呈現(xiàn)明顯的細胞增殖。表明體外病毒感染肝癌細胞成功，病毒攜帶的外源性自殺基因已表達且具有生物學(xué)活性，可用于體內(nèi)治療的實驗研究。
2.2 腫瘤質(zhì)量及抑瘤率 表1結(jié)果表明，各治療組腫瘤質(zhì)量均較模型對照組輕，其中聯(lián)合治療組與模型對照組比較，差異有顯著性意義（P＜0.05）。
2.3 病理學(xué)觀察及半定量分析 各組腫瘤細胞均表現(xiàn)為大小不一，核大深染，形狀不規(guī)則，腫瘤間質(zhì)內(nèi)及瘤周有不同程度的纖維結(jié)締組織增生，腫瘤組織內(nèi)均可見不同程度的大片壞死。模型對照組與六味地黃丸治療組均見腫瘤組織內(nèi)細胞密度較大，自殺基因治療組與聯(lián)合治療組見腫瘤組織內(nèi)細胞密度較低，僅自殺基因治療組腫瘤細胞密度與模型對照組比較差異有顯著性意義（P＜0.05），見表2，圖1。
2.4 腫瘤細胞的增殖與凋亡 六味地黃丸治療組和聯(lián)合治療組核分裂像明顯少于腫瘤模型組和自殺基因治療組，其中聯(lián)合治療組核分裂像最少。增殖核抗原陽性細胞著色部位位于細胞核，呈黃褐色，六味地黃丸治療組與聯(lián)合治療組陽性細胞數(shù)均少于其他兩組，以聯(lián)合治療組陽性細胞數(shù)最少。各治療組腫瘤細胞凋亡較模型對照組明顯增多，以聯(lián)合治療組最明顯，見表3，圖2-4。表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較表2 各組病理分析統(tǒng)計結(jié)果表3 各組腫瘤細胞增殖與凋亡檢測結(jié)果
3 討論
自殺基因是指在一定條件下，可以引起細胞自動死亡的基因。目前常用的自殺基因是通過編碼病毒或細菌的酶介導(dǎo)敏感性，而這些酶能把藥物的無活性形式轉(zhuǎn)化為毒性代謝產(chǎn)物，從而抑制核酸合成，導(dǎo)致細胞死亡［16］。
HSVtk/GCV為目前研究最深入、最具有應(yīng)用前景的腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)之一，已廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤的治療，并已進入Ⅲ期臨床實驗。HSVtk基因在腫瘤細胞內(nèi)表達胸苷激酶，可催化核苷類似物，如丙氧鳥苷（GCV）等形成單磷酸化產(chǎn)物，并在細胞內(nèi)磷酸激酶作用下形成三磷酸產(chǎn)物，干擾細胞分裂時DNA合成，從而導(dǎo)致細胞死亡［17］。
自殺基因治療由于存在旁觀者效應(yīng)（bystander effect）的獨特機制已成為惡性腫瘤基因治療的研究熱點和最具有應(yīng)用前景的腫瘤基因治療方法。所謂旁觀者效應(yīng)是指導(dǎo)入了自殺基因的腫瘤細胞加入前體藥物后，不僅自身被殺死，其鄰近未導(dǎo)入自殺基因的細胞也被殺死的現(xiàn)象［18］。由于存在旁觀者效應(yīng)，自殺基因療法對腫瘤細胞的殺傷作用被有效地放大。旁觀者效應(yīng)形成機制的假說主要包括［18］：(1)"縫隙連接"機制；(2)免疫介導(dǎo)機制；(3)"細胞凋亡"機制；（4）介質(zhì)機制；(5)抗腫瘤血管生成機制，等等。
由于免疫介導(dǎo)機制在體內(nèi)自殺基因療法旁觀者效應(yīng)中的重要作用。改善自殺基因抗腫瘤作用的炎癥免疫微環(huán)境是提高自殺基因療法療效的重要策略?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，滋陰補腎代表復(fù)方六味地黃丸（湯）對機體細胞免疫和體液免疫均有明顯的增強效應(yīng)；能明顯改善荷瘤機體的免疫狀態(tài)，并具有一定的直接抗腫瘤作用。我們以六味地黃丸的免疫藥理作用與腫瘤自殺基因療法旁觀者效應(yīng)的免疫介導(dǎo)機制之內(nèi)在聯(lián)系為研究的切入點，以實驗性肝細胞癌為治療對象，比較研究了自殺基因療法聯(lián)合六味地黃丸治療與單純自殺基因治療或單純六味地黃丸治療的抗腫瘤效果。研究結(jié)果顯示：聯(lián)合治療組對腫瘤生長的抑制作用較單純自殺基因治療組或單純六味地黃丸治療組更為明顯［14］。
在進一步的病理學(xué)研究中，雖然病理學(xué)觀察表明自殺基因治療組與聯(lián)合治療組的腫瘤組織內(nèi)細胞密度較低，各治療組纖維組織增生均較明顯，但通過盲法對腫瘤的病理定量分析研究則顯示腫瘤細胞密度、腫瘤壞死、間質(zhì)反應(yīng)各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。造成這種現(xiàn)象的原因最有可能是觀察者不能很好地把握分級標準，以及病理半定量分析的不夠精確，這有待于通過多次的重復(fù)實驗及增加樣本量或運用更為精確的分析方法（如圖像分析等）來解決。 腫瘤的生長速度與腫瘤細胞的增殖與凋亡速度相關(guān)。PCNA與細胞核分裂像均為評價細胞增殖能力的重要指標。本實驗結(jié)果顯示：聯(lián)合治療組與六味地黃丸治療組的PCNA陽性細胞數(shù)及核分裂像數(shù)均少于模型組、自殺基因治療組，其中聯(lián)合治療組與模型組、自殺基因治療組比較，差異均有顯著性意義(P＜0.05)，結(jié)果說明六味地黃丸可能具有一定的抑制腫瘤增殖的作用；其他各組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而自殺基因治療組從絕對值看略高于模型對照組，其結(jié)果與文獻報導(dǎo)自殺基因治療后殘存腫瘤細胞會加速增殖相符。同時，從本實驗結(jié)果來看，各治療組腫瘤細胞凋亡均有增多，聯(lián)合治療也顯示了更明顯的誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的效果。
本研究結(jié)果提示：腫瘤細胞增殖抑制和腫瘤細胞凋亡增多都與六味地黃丸對肝癌自殺基因治療的增效作用有關(guān)。其機理可能是在六味地黃丸的參與下，不僅發(fā)揮了直接抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的功效，而且通過對機體整體與局部的抗腫瘤免疫的調(diào)節(jié)或其他機制（如"縫隙連接"機制等），使得自殺基因治療的旁觀者效應(yīng)在力度上得以增強，在時限上得以延續(xù)，從而更好地發(fā)揮了自殺基因療法的抗腫瘤作用。
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【關(guān)鍵詞】超聲微泡；雙自殺基因慢病毒載體；基因治療
【中圖分類號】R341 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2012）13-0013-02
目前，基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式，其中自殺基因治療是一種頗具臨床應(yīng)用潛力的治療策略， 但是由于治療的靶向性成為關(guān)系到治療安全性的瓶頸問題。近年來研究表明[1-5]，超聲微泡造影劑有望成為一種新型的體內(nèi)靶向給藥的載體系統(tǒng)。本研究旨在構(gòu)建超聲微泡包裹的特異性雙自殺基因慢病毒載體，為臨床實時可視狀態(tài)進行超聲定位控釋和載質(zhì)粒微泡基因治療奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的構(gòu)建與包裝
1.1.1目的基因的擴增與TA克隆
提取正常人外周血gDNA，并通過PCR方法擴增出KDRP、CD、TK基因；回收
PCR產(chǎn)物并分別將其鏈接到pMD18-T載體上，構(gòu)成重組T質(zhì)粒；抽提質(zhì)粒，并對各重組T質(zhì)粒的酶切鑒定及測序；
1.1.2 慢病毒載體構(gòu)建與包裝鑒定
將經(jīng)測序證實的T-KDRP、T-CD、T-TK三種質(zhì)粒上的KDRP、CD、TK元件通過特定的限制性內(nèi)切酶酶切后，依次連接到經(jīng)相應(yīng)酶酶切的pLenti6-EGFP載體上，經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至293T細胞，24h后通過熒光顯微鏡即可見GFP熒光表達，72h后收集上清，0.45um濾器過濾，25000rpm離心90min，沉淀溶于Hanks溶液，-80℃貯存?zhèn)溆?。將梯度稀釋的病毒液，加?93T細胞中，72h后置于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，計數(shù)發(fā)熒光細胞數(shù)目，根據(jù)病毒用量和稀釋度計算滴度。按公式計算病毒滴度：
病毒滴度=GFP細胞陽性數(shù)×病毒上清稀釋倍數(shù)/0. 4m1（pfu/ml）。
1.2 載藥粒微泡的制備于鑒定
1.2.1載藥粒微泡的制備
聲諾維sonovue為磷脂包裹的六氟化硫（SF6），按使用說明注入生理鹽水5 ml震蕩形成微泡混懸液。取50ul微泡懸液于1.5mlEP管內(nèi)，再滴加入100MOI病毒載量的病毒上清液，輕輕混勻后室溫孵育20 min。
1.2.2載藥粒微泡的鑒定方法。
采用Malvern激光測量儀檢測載藥微泡的粒徑大小，光學(xué)顯微鏡觀察其外觀，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定載藥微泡的包封率和載藥量。
（1）粒徑大小比較
載質(zhì)粒微泡為白色混懸液，PBS（Phosphate buffered saline 磷酸鹽緩沖生理鹽水）沖洗，靜置后分三層，上層、中間層為微泡，下層為PBS液。去除上層及下層液，取中層液，測定其粒徑大小，鏡下比較觀察載藥微泡與空白微泡外觀。
（2）包封率的測定
將制備好的含有慢病毒載體的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混勻，6℃，16000 rpm高速離心20min，去上層微泡，取下層液體，加5%乙醇0.5 mL稀釋沖洗，再加入適量乙醚，漩渦振搖，6000 rpm離心15 min，取乙醚層，50℃水浴揮干后，加0.5 mL甲醇溶解作為樣液，進樣量10μL。采用RP-HPLC測定雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率，按下式計算包封率：
包封率（%）=[（投入藥量―游離藥量）/投入藥量]×100%
（3）載藥量的測定
以下式計算載藥量：
載藥量%=（Wt～Wi）/Wc×100%
其中Wt為脂質(zhì)微泡溶液中藥物總含量，Wi為游離藥物量，Wc為磷脂用量。
（4）穩(wěn)定性測定
4℃冰箱貯存，對短期內(nèi)的載藥微泡溶液的質(zhì)量進行監(jiān)測。
取少量載藥微泡混懸液分別于1d、2d、5d、8d、10 d經(jīng)光學(xué)顯微鏡（×400）進行觀察其形態(tài)變化。第10 d的取該樣品由Malvern粒徑測量儀檢測粒徑。4℃冰箱貯存10 d后，RP-HPLC測定載藥微泡溶液的包封率。
2 結(jié)果
2.1 病毒滴度檢測結(jié)果：
經(jīng)熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，計數(shù)發(fā)熒光細胞數(shù)目，根據(jù)病毒用量和稀釋度，獲得病毒滴度為（3.5×1012pfu/L）的雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK。
2.2 載藥微泡質(zhì)量鑒定：
2.2.1包裹有pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的聲諾維微泡與空白聲諾維微泡粒徑的對比觀察：
載質(zhì)粒微泡呈乳白色混懸液，用磷酸鹽緩沖生理鹽水（Phosphate buffered saline PBS）沖洗，靜置后分三層，上層、中間層為微泡，下層為PBS液。
鏡下比較觀察載質(zhì)粒微泡（圖A）與空白微泡（圖B）的形態(tài)，其形態(tài)相近，為近似的圓形微泡。其粒徑范圍92%在2～5μm之間，平均粒徑約2.90μm（圖A），粒徑大小均相似。
2.2.2 包封率和載藥量測定結(jié)果
采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定載藥微泡的包封率和載藥量，
得到結(jié)果：
包封率為90.6±3.1%。載藥量為29.2±0.9%。
2.2.3 穩(wěn)定性測定：
4℃冰箱貯存10 d后，可見仍為乳白色混懸液，光鏡下觀察，微泡粒徑大小未見明顯變化，微泡形態(tài)好，大小均勻，相互之間無明顯聚集現(xiàn)象，分層情況基本同前，樣品經(jīng)光鏡下觀察及Malvern測量儀檢測發(fā)現(xiàn)，與制備初始相比，平均粒徑大小約3.08μm），未見明顯變化；RP-HPLC測得包封率：86.1±2.8%，沒有出現(xiàn)明顯藥物滲漏。
3 討論
基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式，其中自殺基因治療是近年來新興的腫瘤基因治療的研究熱點。自殺基因療法是利用基因工程技術(shù)將自殺基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞進行表達，注入體內(nèi)的無毒或低毒的前藥在表達的特異性酶作用下轉(zhuǎn)化成毒性產(chǎn)物，該產(chǎn)物可作為DNA合成的核苷替代物摻入到DNA中，干擾細胞DNA的合成，從而引起腫瘤細胞的死亡[6]。
本研究所采用的克隆方法并不是將PCR產(chǎn)物直接與表達載體相連接，而是先將PCR產(chǎn)物TA克隆，構(gòu)建成重組T質(zhì)粒后再將目的基因與表達載體酶切連接，主要是考慮到：PCR產(chǎn)物直接進表達載體成功率不高；而先進T載體，再酶切連接表達載體，可減少堿基錯配，提高成功率。目前己發(fā)現(xiàn)的自殺基因體系已有十多種，本實驗選擇胞嚓陡脫氨基酶基因（CD）和單純疤疹病毒胸普激酶基因 （HsV-TK簡稱TK）來構(gòu)建雙自殺基因質(zhì)粒，是因為研究表明[7]，二者作用機制具有很強的互補性，將其連接在一起，構(gòu)成融合基因，使兩個自殺基因體系協(xié)同作用，能顯著增強對腫瘤細胞的殺傷作用。同時選用腫瘤特異性啟動子KDRP，突破對腫瘤細胞類型的依賴性，擴大腫瘤基因治療譜。運用增強型GFP綠色熒光蛋白作為報告基因，可直觀的檢測目的基因的檢測和計算病毒滴度。而慢病毒載體最大的特點是可以感染分裂期及非分裂期細胞，容納外源性目的基因的片段大，可以在體內(nèi)長期地表達，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，安全性較好，可在更多范圍的宿主細胞內(nèi)生成高滴度的病毒，己成為當(dāng)前基因治療中載體研究的熱點。
超聲微泡造影劑聲諾維可作為一種新型基因載體。在一定劑量超聲波的輻照下，利用微泡在超聲介導(dǎo)下的空化效應(yīng)介導(dǎo)目的基因的靶向釋放和導(dǎo)入。國內(nèi)外許多學(xué)者通過體內(nèi)外實驗證實空化效應(yīng)是超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的主要機制，微泡造影劑作為外源性空化核被引入體內(nèi)后大大增加了單位體積內(nèi)空化核的數(shù)量，降低超聲波的空化閉值，增強空化效應(yīng)，從而提高基因轉(zhuǎn)染效率[3-4]，尤其在抗腫瘤治療、溶栓治療等方面具有潛在的重要應(yīng)用價值。經(jīng)靜脈注入載藥微泡后，用超聲輻照特定部位，含氣體的超聲造影劑在超聲波作用下會不斷地產(chǎn)生非對稱性收縮和膨脹，當(dāng)聲能達到一定強度時，微泡破裂藥物被釋放到超聲所輻照的局部組織中。在這一過程中，微泡作為空化核增強空化效應(yīng)，依靠能量輻射作用，使微泡破壞后釋放的藥物能夠進入血管壁甚至組織間隙，從而發(fā)揮定位靶向治療作用[2]。
而載藥微泡的外觀、粒徑大小、包封率、載藥量等是衡量載藥脂質(zhì)微泡質(zhì)量的最重要指標。我們制作的載雙自殺基因慢病毒載體微泡乳化良好，大小均勻，粒徑范圍92%在2-5μm，與空白微泡相似。微泡內(nèi)藥物的包封率為90.6±3.1%，載藥量為29.2±0.9%，均達到較理想的水平。此外穩(wěn)定性也是衡量載藥脂質(zhì)微泡特性的主要指標之一，它能反映脂質(zhì)微泡溶液包封率隨時間變化的情況。脂質(zhì)微泡作為藥物載體穩(wěn)定性是指被包裹藥物在脂質(zhì)微泡中的滯留性。經(jīng)由本實驗證實，我們制作的載藥微泡同時也具有較高的穩(wěn)定性。
本研究聯(lián)合了雙自殺基因的殺傷效應(yīng)、KDR啟動子的腫瘤特異性、慢病毒載體的高載性和超聲微泡靶向的可控釋性等多種技術(shù)優(yōu)點，制備出了較為理想的載有靶向基因藥物的微泡，期望為進一步臨床實施可視狀態(tài)下的腫瘤的基因治療提供一種更加安全、高效的策略。
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作者簡介：
郝軼，碩士，主治醫(yī)師，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，830011。
基金項目：
新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號：2011211B19）Correspondence to：HAO Yi（郝軼）
