時間：2023-07-05 16:12:40
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關(guān)鍵詞: 胃腫瘤;腫瘤基因;基因療法;述評
中圖號:R735.2
引言
腫瘤發(fā)生的直接原因是基因的改變，致使正常細胞轉(zhuǎn)變成腫瘤細胞，癌基因的激活與抑癌基因的失活起了重要作用.近年來與胃癌發(fā)生有關(guān)的癌基因和抑癌基因受到重視，如何扭轉(zhuǎn)或恢復癌基因或抑癌基因的異常改變也成為防治胃癌的研究熱點.
1 胃癌相關(guān)基因
1.1 癌基因
已知與胃癌相關(guān)的癌基因有:c-myc，ras，hst，c-erbB-2，k-sam，n-myc，met，p53（突變型）等.它們通過點突變、擴增或易位在腫瘤的啟動、促癌以及進展階段過度表達，引起胃粘膜上皮細胞轉(zhuǎn)化和無限制的增殖，最終導致胃癌的形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)化.在各種癌基因中ras基因特別是h-ras基因與胃癌的關(guān)系比較密切，其所編碼的蛋白質(zhì)rasp12具有調(diào)節(jié)細胞生長和分化的功能，它的異常表達對細胞惡變和胃癌的惡性表形起著重要作用.此外，還有一些分子對胃癌細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等惡性行為有關(guān).如增殖細胞核抗原（PCNA）、端粒酶、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 （TGF-β1 ）、免疫抑制酸性蛋白（IAP）等.
1.2 抑癌基因
抑癌基因存在于正常細胞中，是細胞正常增殖的穩(wěn)定因素，Rb基因是最早發(fā)現(xiàn)的人體抑癌基因.此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種抑癌基因，和胃癌有關(guān)的有p53，DCC，APC，MCC等.p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，定位于17號染色體短臂上.野生型p53基因在細胞損傷修復過程中，監(jiān)視著基因組DNA的完整性.當細胞受到射線或某些藥物作用而發(fā)生DNA損傷時，p53基因所編碼的蛋白能使細胞分裂停止在G1/S期，使細胞充分修復DNA的損傷使之恢復正常.倘不能恢復，野生型p53基因還能啟動細胞的凋亡過程從而引導細胞的程序性死亡，阻止具有癌變傾向的突變細胞出現(xiàn).但野生型p53基因很容易發(fā)生突變，轉(zhuǎn)變成突變型p53基因.突變型p53基因不但喪失了抑制腫瘤發(fā)生的作用，反而具有致癌作用，成為癌基因.定位于18號染色體長臂的DCC基因，定位于5號染色體短臂的APC基因和MCC基因也是近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，它們的缺乏或突變常見于結(jié)、直腸癌，也可在胃癌中發(fā)現(xiàn).此外nm23和p16基因也被認為是腫瘤抑制基因.
2 基因治療
利用分子遺傳學技術(shù)干預靶細胞的有關(guān)基因，從而使腫瘤的發(fā)生和生長受到控制的基因治療方法是近年來研究的熱點之一.基因治療的策略大致有:①原位修復有缺陷的基因;②將抑癌基因?qū)肽[瘤細胞;③應用反義核糖酸封閉mRNA，以抑制癌基因的表達;④將具有殺傷腫瘤細胞能力的細胞因子（如IL-2，TNF，IFN）基因?qū)肽[瘤細胞或淋巴細胞，再將其注入腫瘤患者或荷瘤動物;⑤將自殺基因?qū)肽[瘤細胞，例如把單純皰疹病毒的胸苷激酶（HS-TK）基因轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，使癌細胞對抗腫瘤藥羥甲基無環(huán)鳥苷敏感，然后用該藥殺滅腫瘤細胞.近年來，筆者等曾對胃癌細胞株及裸鼠體內(nèi)的移植性胃癌進行了基因治療的實驗觀察，初步實驗結(jié)果簡述如下.
2.1 野生型p53基因轉(zhuǎn)染胃癌細胞
SGC7901胃癌細胞轉(zhuǎn)染了野生型p53的cDNA之后稱為SGC7901/Wt.p53細胞，與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的CGC7901相比，其生長速度減慢，細胞倍增時間延長，細胞形態(tài)也有改變.胞體變小，胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)凝集成團塊狀或呈邊集現(xiàn)象，并呈現(xiàn)凋亡征;流式細胞儀的分析圖上出現(xiàn)凋亡細胞峰.裸鼠體內(nèi)移植瘤的實驗表明SGC7901/Wt.p53細胞致癌率明顯降低，成瘤后其生長速度減慢，與對照組比較，腫瘤體積明顯細小，荷瘤動物存活時間也明顯延長.
2.2 脫氧胸苷激酶（TK）基因轉(zhuǎn)染胃癌細胞將TK基因轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細胞
由于TK的表達產(chǎn)物可使羥甲基無環(huán)鳥苷（GCV）變?yōu)榧毎拘晕镔|(zhì)，以殺死腫瘤細胞，原來對GCV無反應的SGC7901經(jīng)轉(zhuǎn)染了TK基因后可被GVC殺傷.試管內(nèi)實驗荷瘤裸鼠體內(nèi)試驗證明GCV對其具有殺傷和抑制作用.
2.3 PCNA的反義轉(zhuǎn)染胃癌細胞
增殖細胞核抗原是DNA聚合酶的輔助因子，為DNA合成所必需.它在DNA復制、細胞增殖及細胞周期調(diào)控過程中發(fā)揮了重要的作用.利用RCNA的反義RNA可抑制PCNA的表達，從而改變腫瘤的惡性行為.當SGC7901胃癌細胞被轉(zhuǎn)染了PCNA反義RNA后，其生長速度減慢，并出現(xiàn)細胞變性、壞死及凋亡.裸鼠移植試驗證明，腫瘤形成緩慢，瘤體縮小.
2.4 端粒酶反義RNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞
端粒酶存在于各種惡性腫瘤細胞中，它具有復制染色體末端DNA，延長端粒長度和維持細胞增殖能力的作用，它的活化是惡性腫瘤細胞無限制增殖的重要基礎(chǔ).根據(jù)作者的觀察，在38例胃癌、29例癌前病變、38例臨近胃癌的正常胃組織和3例胃癌細胞系中，端粒酶活 性表達率分別為84.2%，17.2%，5.2%和100%.實驗證明將端粒酶反義RNA轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細胞后，出現(xiàn)細胞變性、壞死、凋亡等現(xiàn)象.其產(chǎn)生胃癌相關(guān)抗原（MGB2Ag）的能力下降，端粒長度短，細胞生長速度減慢，在裸鼠體內(nèi)致癌性降低.
2.5 周期蛋白DI反義RNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞
周期蛋白（cyclin）D1在細胞周期的調(diào)控中具有重要作用，它能夠縮短細胞周期，促進細胞增殖及導致細胞癌變.Cyclin D1基因位于11號染色體長臂，被視為一種癌基因，將cyclin D1的反義RNA轉(zhuǎn)染CGS7901胃癌細胞系后，可使細胞倍增時間延長，處于G0/G1期的細胞增多而處于S期的細胞減少，對裸鼠的致癌能力也下降.
2.6 針對cerbB2特異性核酶基因轉(zhuǎn)染胃癌細胞
[關(guān)鍵詞] 骨關(guān)節(jié)炎;治療;綜述
[中圖分類號] R684.3 [文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701(2010)02-14-03
Treatment of Osteoarthritis:New Progress
XIAO DongliangZHAO Jinmin
Department of Orthopedic Trauma and Hand Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China
[Abstract] Osteoarthritis(OA) is a common clinical degenerative disease,the number of patients gradually increases and its incidence increases with increasing age. There have been a great number of researches on its pathogenesis,drug and surgical treatment,with considerable progress in recent years.
[Key words] Osteoarthritis;Treatment;Review
骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)又稱退行性關(guān)節(jié)炎,是一種慢性、漸進性、退行性關(guān)節(jié)病變,是中老年人的常見疾病。其發(fā)生率隨年齡的增長而升高,據(jù)統(tǒng)計我國50歲以上人口發(fā)病率為5%,膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率為9.56%;60歲以上人口發(fā)病率為20%,膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率為78.5%。保守估計,我國不同程度的OA患者至少在3000萬以上,OA是致殘的重要原因之一,很多患者后期只能選擇關(guān)節(jié)置換。臨床治療方法很多,但迄今還沒有一種治療方法能有效阻斷OA的病理進展過程,因此,目前的治療目標主要是止痛和改善功能。本文對其治療方法簡述如下。
1藥物療法
目前多采用藥物治療OA,治療藥物主要可以分為兩大類。
1.1解熱鎮(zhèn)痛和非甾體類抗炎藥
如非類固醇消炎藥(nonsteroidant inflammatory drugs,NSAID),但這些藥物的使用是有風險的,而且其有效性是否優(yōu)于安全性尚無肯定的評價。根據(jù)臨床試驗報告,應用NSAID藥物的OA患者中,只有30%可以減輕疼痛,15%可以改善功能。非甾體類抗炎藥在一定的程度上能夠改善骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀,但近年來己經(jīng)發(fā)現(xiàn)這類藥物可抑制關(guān)節(jié)軟骨中的基質(zhì)成分蛋白多糖的合成,加速關(guān)節(jié)軟骨的退行性變,遠期療效不容樂觀。
1.2可改變骨關(guān)節(jié)炎病程的藥物
主要有透明質(zhì)酸、硫酸氨基葡萄糖、S-腺苷甲硫氨酸、胰島素、雌激素和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。在拮抗病變中致軟骨退變因子的藥物中,四環(huán)素最為常用。在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中,基質(zhì)金屬蛋白酶的活性增強對于軟骨基質(zhì)的降解起著關(guān)鍵性的作用,而四環(huán)素可通過抑制金屬蛋白酶的活性,阻止膠原的分解和軟骨的破壞。四環(huán)素族中以多西環(huán)素,二甲胺環(huán)素的作用最強。過氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)能夠清除組織代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和氫氧根。研究證實,這些代謝產(chǎn)物的堆積可引起組織損傷,軟骨破壞和纖維化改變。用牛肝提取的SOD商品名Orgetin,行關(guān)節(jié)內(nèi)注射能有效的緩解骨關(guān)節(jié)疼痛,其療效與皮質(zhì)類固醇激素相當,但作用緩慢、療效近期不佳。
評價:這些藥物療法的共同特點是:治療OA的確切機制還在研究當中,已獲準在臨床使用,并獲得一定的臨床療效,無明顯毒副作用,可長期安全使用。雖然有些藥物起效慢,但也有一定的鎮(zhèn)痛作用,能減少患者對NSAID的需要量,能延緩OA的進展。
2中醫(yī)療法
中醫(yī)中藥的研究較多[1,2],既有傳統(tǒng)的活血化瘀、內(nèi)服外敷的復方中草藥,針刺,溫灸等方法,又有結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學成果發(fā)展起來的電針、水針及針刀療法。尤其是近年發(fā)展起來的針刀療法,除有針刺作用外,還可以對患者膝周軟組織“筋傷”進行松解、剝離和切割,彌補了傳統(tǒng)針灸的不足,提高了療效和縮短了療程,并且理論上也為針灸治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎提供了一種新的思路。
評價:中藥內(nèi)服、推拿理療、局部外用藥、膏藥、搽劑、離子導入、針灸療法和小針刀療法等治療方式不能阻礙病情的進展,大多數(shù)只作為綜合治療的一部分,能部分緩解骨性關(guān)節(jié)炎的癥狀、延緩病情發(fā)展,但仍然沒成為公
認明確有效的治療方法。
3注射療法
注射療法可分為局部痛點注射和關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射。其特點是藥物直接到達病灶局部,可以消除炎癥刺激,緩解肌肉緊張或肌痙攣,改善局部血液循環(huán),制止原發(fā)和激發(fā)的疼痛。注射療法的藥物選擇有皮質(zhì)激素、維生素B族類、利多卡因及消炎鎮(zhèn)痛藥等。近年來采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉對早中期骨性關(guān)節(jié)炎有良好的作用,對晚期骨性關(guān)節(jié)炎也有一定的療效,對創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、滑膜炎患者療效肯定,尤其對干燥綜合征療效明確,不良反應較少。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)屬粘多糖物質(zhì),是關(guān)節(jié)液及軟骨基質(zhì)的主要成份,當發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎時,HA在關(guān)節(jié)內(nèi)的產(chǎn)生和代謝發(fā)生異常,滑液中的HA濃度和相對分子量明顯降低,作用下降,而使關(guān)節(jié)軟骨表面受到破壞。賈經(jīng)漢[3]膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉結(jié)合功能鍛煉治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病160例170膝,療效滿意。曲安奈德、生理鹽水及利多卡因混合膝關(guān)節(jié)腔注射,也得到類似效果。消炎鎮(zhèn)痛藥物局部應用,可有效降低其對患者的副作用評價:玻璃酸鈉、曲安奈德、生理鹽水及利多卡因混合膝關(guān)節(jié)腔注射,消炎鎮(zhèn)痛藥物局部應用,大多可緩解病人的疼痛癥狀、療效經(jīng)過臨床證實也較明顯。但是,短時間內(nèi)多次大量注射皮質(zhì)類固醇類藥物,可加重骨關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的損害,進一步加重病情。同時注射時若消毒不嚴格,可能引起關(guān)節(jié)腔內(nèi)感染,導致嚴重后果。
4外科手術(shù)療法
目前手術(shù)方法主要有以下幾種:切開直視下清理術(shù)、關(guān)節(jié)鏡下清理術(shù)、軟骨下鉆孔術(shù)、膝關(guān)節(jié)融合術(shù)、截骨術(shù)、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)和軟骨移植術(shù)。經(jīng)過正規(guī)的非手術(shù)治療而效果不佳,或者癥狀較重而影響日常生活的患者,可以考慮外科手術(shù)治療。
4.1軟骨下鉆孔術(shù)
骨關(guān)節(jié)炎患者早期關(guān)節(jié)的主要病理改變是軟骨端松質(zhì)骨髓內(nèi)靜脈引流不暢,骨內(nèi)靜脈回流受阻所致的骨內(nèi)靜脈瘀滯[4],進而形成骨內(nèi)壓增高,引起疼痛與功能障礙。因此,早期的骨性關(guān)節(jié)炎可采用軟骨下鉆孔減壓術(shù),以緩解疼痛癥狀。
4.2關(guān)節(jié)鏡下手術(shù)
隨著微創(chuàng)手術(shù)的發(fā)展,腔鏡被大量用于骨性關(guān)節(jié)炎的診斷和治療,關(guān)節(jié)鏡下治療骨性關(guān)節(jié)炎具有安全、有效、創(chuàng)傷小、手術(shù)時間短,術(shù)后康復快,可重復,并發(fā)癥少等優(yōu)點,是治療早、中期骨性關(guān)節(jié)炎的一種較好方法。關(guān)節(jié)鏡下雙極射頻技術(shù)具有融切溫度低和組織熱損傷小的顯著優(yōu)點。雙極射頻的工作溫度為40～70℃,它通過離子流使靶組織大分子的氫鍵斷裂,膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)解聚,形成高效精確的汽化融切效果[5]。張克等[6]于關(guān)節(jié)鏡下單純清理沖洗與沖洗清理加鉆孔,術(shù)后隨訪反饋:對于重度OA鉆孔并不能提高遠期療效。
4.3關(guān)節(jié)融合術(shù)
對于嚴重的骨關(guān)節(jié)炎患者,關(guān)節(jié)疼痛嚴重,但因經(jīng)濟或其他原因不能行關(guān)節(jié)置換術(shù)者,關(guān)節(jié)融合術(shù)也是一種手術(shù)方式,特別對從事體力勞動的患者,將病變關(guān)節(jié)融合于功能位,可獲得穩(wěn)定、無痛、能負重的關(guān)節(jié),融合喪失了關(guān)節(jié)動度。但行走不痛,具備有一定的勞動和生活自立能力。
4.4截骨術(shù)
嚴重膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎導致膝關(guān)節(jié)內(nèi)、外翻畸形,需行脛骨高位截骨術(shù)治療,該術(shù)式主要針對較年輕且病情重的患者,從生物力學角度來分該術(shù)式可分為膝內(nèi)側(cè)間隙OA 脛骨截骨術(shù)和膝外側(cè)間隙OA 脛骨截骨術(shù),前者效果優(yōu)于后者。術(shù)前負重位測量解剖軸股脛角(femorotibial angle,FTA),根據(jù)術(shù)前設(shè)計計算的矯正度數(shù)按每1mm 寬矯正1°為標準進行脛骨楔形截骨,截骨的平面至少達脛骨關(guān)節(jié)面遠端2cm。脛骨內(nèi)側(cè)高位截骨術(shù)5年內(nèi)療效最佳,長期隨診資料[7]表明截骨手術(shù)1～3年內(nèi)效果最好,隨著時間的推移,效果則逐漸下降。
4.5人工關(guān)節(jié)置換術(shù)
隨著OA病情的發(fā)展,關(guān)節(jié)破壞嚴重,關(guān)節(jié)置換術(shù)成為最終的手術(shù)選擇。張明等[8]對29膝的骨性關(guān)節(jié)炎病例行人工膝關(guān)節(jié)置換手術(shù),全部采用后方穩(wěn)定性假體,術(shù)后安排專職康復醫(yī)師指導早期功能鍛煉,術(shù)后隨訪所有患者膝活動度均≥90°,除1例雙膝置換的一側(cè)膝關(guān)節(jié)尚有輕度疼痛外,其余患者術(shù)前疼痛經(jīng)手術(shù)治療后均消失、效果較為明顯。
4.6軟骨移植術(shù)
最近有自體軟骨種植術(shù)和移植術(shù)的報道,用關(guān)節(jié)鏡取得200～300mg自體軟骨標本后,行軟骨細胞培養(yǎng)數(shù)周,于病變部位行手術(shù)清理,再將人工培養(yǎng)的軟骨細胞注入關(guān)節(jié)軟骨缺損部,以骨膜縫合覆蓋,并以自體或人工纖維蛋白凝膠加固,術(shù)后制定專門的康復鍛煉計劃。此法適用于股骨髁和滑車的灶性軟骨缺損或剝脫性骨軟骨炎。自體骨軟骨移植的方法是將股骨遠端非承重部位截取的骨柱和自體軟骨移植到股骨關(guān)節(jié)表面,須先處理好的軟骨缺損隧道。上述兩種治療方法,因國內(nèi)報道不多見[9],需作更長時間的隨訪才能明確其遠期療效。
評價:目前手術(shù)治療方法比較常用,特別是關(guān)節(jié)鏡手術(shù)較多并逐年增加,技術(shù)也日益成熟并普及,研究探討也很多。但所有OA手術(shù)治療都不能很好地解決關(guān)節(jié)軟骨修復與重建問題,更不能逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨進一步被破壞的進程,自體軟骨移植法近年開展、比較新穎,但其遠期療效尚待進一步隨訪觀察。
5基因治療法
隨著分子生物學、細胞生物學和免疫生物學等相關(guān)學科的發(fā)展和交叉滲透,基因治療OA已日受關(guān)注,它不僅可以彌補上述各種治療方法的不足,而且還可以針對其發(fā)病機制,在分子水平進行治療。基因治療可分為生殖細胞基因治療(germ cell gene therapy)和體細胞基因治療(somatic cell gene therapy)兩大類,治療策略主要分為:基因替代、基因修正、基因增強、基因抑制(基因失活)基因治療在理想情況下,可特異性地針對靶細胞,并可以調(diào)節(jié)合成、分解代謝之間的平衡,也可以調(diào)控炎性細胞因子的產(chǎn)生。但目前可以用作基因治療的靶向藥物仍然很少,研究的重點主要是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來補充一些骨性關(guān)節(jié)炎中缺乏或者不足的蛋白分子。1992年Bandara等[10]以反轉(zhuǎn)錄病毒為載體,將β半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)移到體外培養(yǎng)的兔滑膜細胞中,擴增后再將轉(zhuǎn)基因細胞回植到兔膝關(guān)節(jié)中,使得β半乳糖苷酶可以在兔的膝關(guān)節(jié)滑膜細胞內(nèi)穩(wěn)定表達3個月,此后許多學者進行了有益的探索。近年來,人們逐漸認識到白介素-1 特別是白介素-1β在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起著致關(guān)重要的作用,并認為白介素-1β水平的不斷升高是骨關(guān)節(jié)炎軟骨進行性退行性變的重要原因之一。如何應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)減少病變關(guān)節(jié)白介素-1的產(chǎn)生或提高白介素-1拮抗劑的表達量,以避免或者延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展,已成為當前人們關(guān)注的焦點。Russel l等[11]在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生之前將(human interleukin-1)hIL-1ra基因?qū)雽嶒瀯游镪P(guān)節(jié)腔,發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)持續(xù)表達的hIL-1ra,可明顯抑制關(guān)節(jié)的炎癥反應,并阻止關(guān)節(jié)軟骨的破壞,從而提出了基因療法在骨關(guān)節(jié)炎的預防和治療中應用的可能性。Amin等[12]用腺病毒載體轉(zhuǎn)染單層培養(yǎng)的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞,并將基因修飾過的軟骨細胞移植到體外培養(yǎng)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨表面,發(fā)現(xiàn)移植的軟骨細胞黏著并且整合入軟骨表而,持續(xù)表達(interleukin-1,IL-1)受體拮抗蛋白(interleukin-1Ra,IL-1Ra)。Fernandes等[13]將兔分為4個實驗組,通過關(guān)節(jié)內(nèi)質(zhì)粒注射觀察局部IL-1Ra基因治療對于半月板切除術(shù)后的兔骨關(guān)節(jié)炎模型結(jié)構(gòu)改變的有效性,觀察到骨贅明顯減小,軟骨組織缺損明顯減小,且減小的程度與IL-1Ra質(zhì)粒的注射量程正相關(guān)。Frisbie等[14]用腺病毒invivo轉(zhuǎn)移馬IL-1Ra基因至馬骨關(guān)節(jié)炎模型中,可提高關(guān)節(jié)內(nèi)IL-1Ra基因表達大約28d,并起到軟骨保護作用。一些學者應用特定的基因轉(zhuǎn)移載體將白介素-1受體拮抗蛋白基因[10]轉(zhuǎn)移到存在病變的關(guān)節(jié)軟骨或滑膜組織中,使該基因在關(guān)節(jié)內(nèi)大量表達,從而阻斷病理狀態(tài)下所產(chǎn)生白介素-1的破壞作用,達到預防、治療和長期維持骨關(guān)節(jié)炎緩解狀態(tài)的目的。在體外培養(yǎng)實驗中,通過基因介導胰島素樣生長因子-1和白介素-1受體拮抗基因,修復軟骨基質(zhì),從而促進受損軟骨再生[15]?；铙w實驗中,將白介素-1受體拮抗基因轉(zhuǎn)入骨性關(guān)節(jié)炎的兔膝關(guān)節(jié),可以有效地阻止骨性關(guān)節(jié)炎的進展[16]。
評價:基因治療是一種新技術(shù)、多學科的療法,但基因治療尚存在以下問題:(1)轉(zhuǎn)移基因在宿主細胞內(nèi)的表達過程難以人為控制,難以得到按需表達、按量表達、按時間表達。(2)病毒載體的安全性尚未完全確認,還不能完全確定其是否存在致癌性和免疫源性。(3)單一的高純度的細胞分離與擴增技術(shù)有待進一步提高。(4)由于OA的發(fā)病涉及到多個因子,故多基因聯(lián)合應用亦應得到更多的關(guān)注?；蛑委熓且环N新興的治療手段,交叉多學科、多領(lǐng)域。雖然目前基因治療OA的實驗室結(jié)果展現(xiàn)了良好的臨床應用前景,但要真正用于臨床治療,還有大量工作要做,有待更深一步的研究。
總之,各種治療方法在動物實驗和臨床上都有嘗試,一些療法也顯示出明顯的療效和優(yōu)越性,但由于骨性關(guān)節(jié)炎的確切病因和發(fā)病機制仍不太清楚,因此對其治療仍難以達到理想的效果,尚無法從根本上阻止和治療骨性關(guān)節(jié)炎。隨著治療新方法、新技術(shù)的不斷出現(xiàn),特別是基因治療理念的引入,有望在不久的將來可改變治療骨關(guān)節(jié)炎的現(xiàn)狀。
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【關(guān)鍵詞】基因診斷；單基因遺傳病；應用；分析
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.112文章編號：1004-7484（2014）-05-2498-01
1前言
單基因遺傳病是導致患者出生缺陷最重要的一個原因，近幾年在臨床中非常的常見，對于該中遺傳病的研究也逐漸增多。當前多以基因診斷判斷單基因遺傳病，基因診斷的取材非常的方便，診斷的準確性也非常的高，將其應用與單基因遺傳病的診斷工作中，具有非常重要的現(xiàn)實意義。
2基因診斷概述及特點分析
基因診斷在醫(yī)學界中又被定義為分子診斷、DNA診斷?；蛟\斷主要是采取基因檢測的方法，對從患者的體內(nèi)提取到的樣本直接進行檢測，通過檢測基因結(jié)構(gòu)與基因表達水平改變的具體情況，檢測出患者所帶病原體的基因類型，以此作為判斷患者的體內(nèi)是否攜帶著某些病原微生物，或者是基因出現(xiàn)異常情況?；蛟\斷的相關(guān)技術(shù)在近幾年已經(jīng)廣泛應用于單基因遺傳病的臨床診斷中，并取得了一定的功效，對我國衛(wèi)生事業(yè)做出了很大貢獻。
與傳統(tǒng)的單基因遺傳病診斷方法不同，基因診斷的技術(shù)具有其非常鮮明的特點：首先，基因診斷主要是從患者的基因水平層面對疾病的發(fā)病原理、發(fā)病原因進行徹底的揭示。其次，基因診斷還可以用作于癥狀前的分析和診斷，使產(chǎn)前的診斷時間得以有效的縮短[1]。再次，基因診斷還具有來源非常廣且取材非常少的特點，只要有微量的標準，就可以對其進行科學的診斷。最后，由于艾滋病和肝炎等遺傳病的病原體既不能夠在體外進行培植，也不可以在實驗室內(nèi)進行安全培植，給這類病原體的檢測工作帶來影響。但是基因診斷的技術(shù)打破了地域限制，實現(xiàn)對病原體的快速檢測。
3基因診斷在單基因遺傳病中的具體應用
基因診斷在單基因遺傳病中的應用主要包括B型血友病、苯丙酮尿癥、地中海貧血等遺傳疾病中。第一，基因診斷應用于B型血友病。B型血友病是一種隱性的、出血性的遺傳疾病，主要發(fā)病于男性人群中，而且發(fā)病率和散發(fā)率都非常的高。B型血友病是一種對人類健康具有極大危害的遺傳病，在臨床中主要表現(xiàn)為患者在兒童期就出現(xiàn)了嚴重的出血傾向，直到青春期之后出血會自發(fā)的減輕。針對這種遺傳病，目前在臨床醫(yī)學中還沒有找到根治的方法，因此針對高危胎兒與病原攜帶者，給予他們科學有效的基因診斷顯得非常的關(guān)鍵[2]。同時，B型血友病患者基因缺陷的類型也是非常的繁多，不但包括插入和缺失，還包括點突變，而其中又以單個堿基突變?yōu)樽疃嗟囊环N類型。
近幾年，常用來連鎖分析B型血友病的方法主要包括短串聯(lián)的重復序列和限制性片段的長度多態(tài)性等，然而中國人的酶切位點大多都沒有多態(tài)性。連鎖分析的方法具有實驗操作簡單和分析結(jié)果的過程也簡單的特點，而且該診斷方式的有效性與快速性能很高，對于那些攜帶著B型血友病或具有家族遺傳性B型血友病患者的進行產(chǎn)前診斷，具有非常顯著的臨床意義。
第二，將基因診斷的技術(shù)應用于苯丙酮尿癥患者的診斷工作中。苯丙酮尿癥已經(jīng)成為兒科臨床中非常常見的一種氨基酸病，主要是因為苯丙氨酸在代謝的過程中出現(xiàn)酶缺陷，影響了苯丙氨酸順利轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?，而使苯丙氨酸和酮酸的蓄積，最終從患者的尿液中排出。苯丙酮尿癥對于患兒的健康具有非常嚴重的影響，使患兒發(fā)生繼發(fā)性的癲癇病與智能障礙的幾率增加。對于苯丙酮尿癥的診斷，基因診斷的方法具有一定的功效，該方法可以從患兒的DNA水平層面去了解病因，診斷率非常的高，并且能夠在患兒的任何發(fā)育階段對其有核細胞實施診斷，并成為產(chǎn)前診斷研究的依據(jù)。
第三，將基因診斷的技術(shù)應用于地中海貧血患者的診斷工作中。地中海貧血主要是因為珠蛋白的基因發(fā)生了突變，阻礙了其生物合成，且生物合成的產(chǎn)量也不足，導致地中海貧血的發(fā)生。地中海貧血即為珠蛋白突變而生成的具有障礙性特征的貧血，是一組具有遺產(chǎn)性和溶血性的隱性貧血疾病，也是一種常見的遺傳疾病，主要包括α珠蛋白生成障礙性貧血和β珠蛋白生成障礙性貧血這兩種疾病類型。
α珠蛋白生成障礙性貧血大多是由于患者體內(nèi)缺失α珠蛋白基因而生成的，也有部分患者是由于基因點發(fā)生突變而造成的。這種遺傳性疾病多見于我國的南方地區(qū)，即云南、廣西和四川等地方。針對這種疾病的診斷，業(yè)內(nèi)人士大多采取基因診斷的方法進行，并且具有診斷率高的特點。而發(fā)生β珠蛋白生成障礙性貧血的病理非常的復雜，醫(yī)學界通常認為是由于基因點突變而生成，也有少部分患者是由于基因缺失而造成[3]。對于β珠蛋白生成障礙性貧血的診斷工作，業(yè)內(nèi)人士大多采用多重突變基因的特異性擴增系統(tǒng)診斷法，該診斷方法具有簡便和可靠的特點，可以廣泛的應用在基層的醫(yī)療機構(gòu)中，對于那些非缺失型的地中海貧血患者進行產(chǎn)前診斷或者是基因診斷具有顯著的臨床功效。
4結(jié)束語
基因診斷在單基因遺傳病中的應用已經(jīng)越來越受到業(yè)內(nèi)人士的關(guān)注，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)與遺傳學科學的快速發(fā)展和不斷完善，將基因診斷的相關(guān)技術(shù)應用于多基因遺傳疾病中的日子已經(jīng)是指日可待。而基因診斷相關(guān)技術(shù)作為基因治療的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，必然會成為治療人們基因疾病的重要的、主流的技術(shù)，對于提升我國衛(wèi)生事業(yè)具有非常重要的現(xiàn)實意義。
參考文獻
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[關(guān)鍵詞] 核酸適體；靶向配基；腫瘤藥物
[中圖分類號] R943 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2012）10（c）-0005-03
腫瘤的靶向療法是利用特異性“靶向配基”的介導，將藥物或其他殺傷腫瘤的物質(zhì)選擇性地運送到腫瘤部位、選擇性地殺傷腫瘤細胞以提高治療效果的一種治療方法。近年來國內(nèi)外核酸適體（aptamer）介導的主動靶向給藥研究成為熱點。核酸適體（aptamer）是經(jīng)過一種新的體外篩選技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），從隨機單鏈寡聚核苷酸文庫中得到的能特異結(jié)合蛋白或其他小分子物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸，可以是RNA，也可以是DNA，長度一般為25～60個核苷酸[1]。SELEX技術(shù)自Tuerk等[2]1990年發(fā)明以來，在臨床診斷、靶向藥物研制方面得以廣泛應用。首個核酸適配體藥物“Macugen”[3]由美國FDA在2005年批準上市，成為核酸適配體領(lǐng)域的一個里程碑。美國Achemix、SomaLogic，德國Noxxon AG等多個公司正在開發(fā)核酸適配體藥物和診斷試劑。腫瘤細胞靶向給藥是提高腫瘤治療效果減少毒副作用的有效途徑。將藥物偶聯(lián)于腫瘤細胞特異性配體上是靶向給藥的主要方法。核酸能特異性結(jié)合細胞并且隨之內(nèi)化，是理想的靶向細胞輸送劑。核酸適體“靶向配基”介導或修飾的藥物及藥物納米制劑，為主動靶向腫瘤細胞給藥系統(tǒng)構(gòu)建開拓了新方向。本文簡要綜述適體作為腫瘤藥物“靶向配基”的應用研究。
1 核酸適體作為腫瘤藥物“靶向配基”的優(yōu)勢
具有高特異性與親和性“靶向配基”的篩選，是制約主動靶向給藥系統(tǒng)研究的瓶頸[4-5]。以往修飾腫瘤藥物的“靶向配基”是抗體、多肽和葉酸等分子，但這些配基修飾的靶向藥物在實際應用中均存在著難以克服的缺陷。單克隆抗體潛在的免疫原性和制備的困難大大限制了其臨床的應用和產(chǎn)業(yè)化的進程[4]；葉酸等小分子雖然有諸多優(yōu)點，但要求病變組織細胞過多表達葉酸受體，靶向作用才得以實現(xiàn)[4-5]，而核酸適體卻具有以下優(yōu)點：
1.1 高親合力、強特異性
隨著體外高通量篩選技術(shù)SELEX的發(fā)展，篩選出的適體與配體間的親合力很高。單鏈寡核苷酸只識別與其互補的空間結(jié)構(gòu)，幾乎可以完全避免非特異性結(jié)合。
1.2 靶標普適性
適體與靶標的識別不是堿基配對，而是與靶標在空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的匹配，是主動靶向顯像及主動靶向治療的優(yōu)選分子探針。
1.3 成本低廉、篩選制備技術(shù)成熟
目前細胞-SELEX技術(shù)成熟，適體篩選過程已實現(xiàn)自動化[6]；篩選出的適體通過化學合成，純度高、準確性和重復性好。適體經(jīng)適當?shù)幕瘜W修飾[7]，穩(wěn)定性提高，可在常溫下長期保存及運輸。
1.4 無免疫原性
適體在生物體系中不會引發(fā)免疫原性，在治療中無毒性[8]。在“靶向配基”修飾方面更優(yōu)于抗體等。
1.5 受體范圍廣泛
核酸適體結(jié)構(gòu)的多樣性導致其具有從小分子到蛋白質(zhì)，甚至到細胞的受體[9-10]。
核酸不但是生物體基因信息的儲存與傳遞的載體，而且也具有與蛋白類似的功能。越來越多的研究結(jié)果表明功能化核酸參與重要生命過程的調(diào)控。
2 核酸適體在藥物“靶向配基”中的應用
2.1 核酸適體作為靶向藥物
首先核酸適體作為抑制劑能抑制腫瘤生長過程中的相關(guān)靶蛋白。適體AS1411是首先進入臨床研究的抑制癌癥適體藥物，它對腫瘤細胞的作用主要是調(diào)節(jié)核酶活性，損傷DNA，導致細胞凋亡。Laber等[11]進行了AS1411又稱為ARG001臨床用藥劑量研究，實驗表明從1 mg/（kg·d）到10 mg/（kg·d）晚期腫瘤患者都有治療效果而且沒有任何副作用。應用SELEX篩選技術(shù)，Chen等[12]成功得到針對人表皮生長因子受體-3（HER-3）的細胞外部分適體。研究指出其中的適體A30可抑制MCF7人乳腺癌細胞的生長。
2.2 核酸適體為“靶向配基”的Aptmer-siRNA藥物
利用RNA干擾技術(shù)通過siRNA給藥能特異性抑制致病基因的表達，盡管作為藥物，siRNA在多種疾病治療領(lǐng)域有些許研究進展[13]。但siRNA本身不具備對組織或細胞的靶向能力，靶向性仍然是影響該技術(shù)應用到臨床治療上的主要障礙[14]。將核酸適體作為“靶向配基”介導siRNA輸送，能提高siRNA藥物的靶向性。Mcnamara等[15]將核酸適體A10與siRNA連接建立適配體介導的靶向輸送siRNA藥物，干擾PSMA陽性表達的前列腺腫瘤細胞LNCaP生存所需基因的表達，并且體外觀察到，A10-siRNA結(jié)合體明顯抑制腫瘤細胞的生長。Chu等[16]成功制備了適配子A9，適配子A9較A10具有更強的特異性識別前列腺癌變細胞表面抗原PSMA能力。將A9適配體用生物素-親和素方法偶聯(lián)到siRNA鏈上，構(gòu)建靶向復合體A9-siRNA，能特異性抑制PSMA陽性表達的前列腺腫瘤細胞LNCaP生長。研究同時指出A9-siRNA偶合體對基因表達抑制作用與A9-脂質(zhì)體偶合體類似。
2.3 核酸適體為“靶向配基”的納米粒
時下不同材料納米粒因其諸多特點：可控釋，易修飾，載藥性及可工業(yè)化生產(chǎn)等，在靶向藥物傳遞系統(tǒng)研究得到關(guān)注。Chen等[17]將巰基修飾的核酸適配子（aptmer）偶聯(lián)到金納米粒子（AuNPs）表面，制備出朊蛋白特異性的Apt-AuNPs納米光學探針，并成功應用到細胞表面朊蛋白的光散射成像和電子透射顯微成像分析，通過對Apt-AuNPs探針進入細胞的途徑研究表明，窖蛋白核酸適配子介導的內(nèi)吞作用可能是其進入細胞的一個重要途徑。Lili等[18]所在課題組首次成功地用（PAH/PSS）2多層膜以及PAH-g-PEG-COOH修飾了BSA納米粒子，并在粒子表面偶聯(lián)適體AS1411，得到了同時具有靶向功能和pH響應包埋釋放抗癌藥物的納米載體。細胞培養(yǎng)實驗證明這種粒子對肝癌細胞靶向性明顯，載藥后對肝癌細胞毒性增強。將核酸適配體共價結(jié)合到納米藥物載體上可顯著提升腫瘤靶細胞對納米載體的吞噬，增強所載抗癌藥在體外對腫瘤細胞的殺傷作用。
2.4 核酸適體為“靶向配基”的脂質(zhì)體
脂質(zhì)體作為藥物載體是通過細胞的高滲透和高保留效應（enhanced permeability and retention，EPR effect）進行被動靶向。以核酸適體為靶向配基的脂質(zhì)體藥物主動靶向運輸系統(tǒng)既克服了脂質(zhì)體被動靶向的低選擇性，同時提高了藥物的療效。Cao等[19]將核仁蛋白適體（nucleolin，NCL）偶聯(lián)到順鉑脂質(zhì)納米囊上。用連接NCL-適體的順鉑脂質(zhì)體制劑作用MCF-7人乳腺癌細胞，存活率僅為40.5%，而未連接NCL-適體的順鉑脂質(zhì)制劑作用MCF-7細胞，存活率高達88.9%?！鞍邢蚺浠盢CL-適體大大地提高了藥物的化療效果。Kang等[20]篩選得到了sgc8適體，將適體與包裹了熒光素-右旋糖酐（FITC-Dextran，F(xiàn)D）的脂質(zhì)體相連構(gòu)成適體靶向脂質(zhì)體，用其處理有sgc8受體表達的CEM-CCRF細胞和無sgc8受體表達的NB4細胞共同培養(yǎng)，實驗表明該適體靶向脂質(zhì)體對白血病CEM-CCRF細胞具有高度選擇性。
2.5 核酸適體為“靶向配基”的藥物
核酸適體修飾藥物是一種理想的靶向腫瘤藥物制備策略。適體A10能特異性靶向結(jié)合前列腺癌變細胞表面抗原（PSMA）。Bagalkot等[21]將多柔比星扁平的芳香環(huán)與核酸適體A10三維構(gòu)象中的短鏈結(jié)構(gòu)通過非共價作用連接，得到了適體-多柔比星靶向藥物。該適體-多柔比星靶向藥物對PSMA有陽性表達的前列腺癌LNCaP細胞具有高度的特異靶向作用。Chu等[22]將細胞毒蛋白gelonin與anti-PSMA適體連接，發(fā)現(xiàn)其對PSMA陽性的LNCaP表達細胞的毒性比PSMA陰性的PC-3細胞大600多倍。
3 展望
由于核酸適體獨有的特點，適體技術(shù)及其應用成為時下研究的熱點，并在腫瘤的分子水平顯像及應用于腫瘤靶向治療（核酸適體做“靶向配基”），取得令人鼓舞的成果。國內(nèi)譚蔚泓等[23]對適體的研究也贏得國內(nèi)外關(guān)注。將適體技術(shù)嫁接到微納米泡的靶向修飾中，有望實現(xiàn)分子水平的靶向顯像與靶向治療?？傊瑢怂徇m體專家學者一致認為：①核酸適體是潛在靶向藥物配基，同時能做干擾蛋白質(zhì)靶標的靶向藥物，在創(chuàng)新藥物的研制方面具有很大的發(fā)展空間。②核酸適體與抗體相比免疫原性??；與基因治療相比，它可以細胞外或膜蛋白作為靶標，避免必須輸運到細胞內(nèi)的問題。③核酸適體在體內(nèi)的特異性有待驗證，改變篩選條件提高適體特異性。
目前核酸適體的腫瘤醫(yī)學應用國際上還在發(fā)展初期，挑戰(zhàn)與機遇并存，期盼適體技術(shù)在腫瘤的診斷與靶向治療方面發(fā)揮更大的作用。
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關(guān)鍵詞：癌癥；新靶點；端粒酶；甲基轉(zhuǎn)移酶；缺氧誘導因子；基質(zhì)金屬蛋白酶；多靶點藥物
腫瘤細胞的生長和分裂速度高于正常細胞，且往往可轉(zhuǎn)移到其他組織。據(jù)WHO的統(tǒng)計數(shù)字，2007年全球新確診的腫瘤患者多達1200萬人，而過去幾年來全球每年死于癌癥的患者高達700萬人以上。這一數(shù)字已與死于急性心血管病的人數(shù)非常接近。超過70%的癌癥死亡發(fā)生在低收入和中等收入國家，預計到2080年將有1200萬人死于癌癥。中國衛(wèi)生部的統(tǒng)計資料顯示：目前中國每年新生腫瘤患者總數(shù)約2127萬人左右，其中，惡性腫瘤現(xiàn)有患者約148.5萬左右[1]。目前，由于對腫瘤特性及化療藥相互作用的了解，化療已變成標準療法，單用或者與其他方法聯(lián)用，但是化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，也會損害正常細胞和免疫細胞。因此，患者治療中普遍會有惡心、嘔吐、脫發(fā)、中性粒細胞減少等副作用。至今為止，幾乎對癌癥的治療幾乎沒有很好的方法，所以加快研發(fā)抗腫瘤效果更好的新藥也是刻不容緩。
這些年來，抗腫瘤藥物關(guān)注的靶標大多集中于把腫瘤細胞殺死，但部分未殺死的細胞和幾乎難以殺死的腫瘤"干細胞"（或者稱為腫瘤起始細胞）仍舊存活，這些細胞會在傳統(tǒng)治療后，再次轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤導致抗腫瘤化療藥物，對化療產(chǎn)生耐藥性、復發(fā)和轉(zhuǎn)移。如何將這部分癌細胞殺死是治療癌癥的一大難關(guān)。近年來，人們對于根據(jù)腫瘤的特異性靶點而研發(fā)的抗腫瘤藥物已逐漸普遍關(guān)注，因為這類藥選擇性高、毒性低。本文就端粒酶、甲基轉(zhuǎn)移酶及缺氧誘導因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等幾個抗腫瘤新靶點和目前研究較多的多靶點抗腫瘤藥物做一簡述。
1 端粒酶
端粒酶由人端粒酶模板RNA（hTR）、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）和端粒酶相關(guān)蛋白組成。端粒是細胞必需的遺傳組分，它的主要功能為自身的模板功能和斷端修復功能，通過端粒酶的作用使端粒的長度維持不變，補償染色體末端遺傳信息的丟失，細胞因此獲得永生化。惡性腫瘤細胞中染色體的端粒和端粒酶的活性均明顯高于正常體細胞。因此，在正常細胞到腫瘤細胞的轉(zhuǎn)變中，端粒酶是關(guān)鍵性物質(zhì)，是進行抗腫瘤治療的新的重要靶點，為腫瘤治療開辟了一條新的思路[2]。
1.1 端粒酶與腫瘤 在癌細胞的無線增值中，端粒酶的研究與其之間存在著何種關(guān)系？Harley在很早以前就提出了"端粒-端粒酶"假說。他認為：由于端粒酶缺乏活性，隨著不斷進行的二倍體細胞有絲分裂，端粒的長短則會發(fā)生不斷縮短，當其縮短到一定程度，則會觸發(fā)某種信號，從而在檢查點（check point）對細胞周期進行阻斷，細胞從細胞周期退出后發(fā)生衰死。但其中在次階段有少數(shù)細胞端粒酶活性由于受到某種因素的影響而被激活，從而使其能夠在一定長度上得到維持并不再縮短，從而使染色體得到問題，細胞因此也逃過死亡轉(zhuǎn)變?yōu)闊o限增殖的"永生性細胞"。目前，已經(jīng)越來越多的事實對這一假說進行證實，人們對一些正常人體組織及幾百個腫瘤標本進行檢測，人原發(fā)腫瘤和腫瘤細胞系中大約有80%～90%以上均能有端粒酶活性檢測出，如肉瘤、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等組織中，而在正常人體組織中則不能表達（在人造血干細胞、一些淋巴細胞核生殖細胞中除外），提示端粒酶在腫瘤的發(fā)展過程中具有至關(guān)重要的作用，可能屬于一個廣泛的腫瘤標志。所以端粒酶活性顯然是惡性腫瘤的一種標志。
1.2端粒酶與腫瘤治療 在端粒酶活性抑制中將端粒酶作為一個有用的靶點，使用反義核酶和寡核苷酸進行。由于hTR亞單位的RNA模板序列在端粒末端能夠有效粘合，而寡聚物抑制劑可以與其天然的雜交。最近，在抗端粒酶途徑中也將其hTERT亞基作為靶點，這是由于hTERT的mRNA其二級結(jié)構(gòu)更為復雜，hTERT被認為是一個相比hTR而言，更具挑戰(zhàn)性的靶點[3]。在腫瘤抑制中，針對端粒酶的靶點[4]包括以下幾個：①以人類逆轉(zhuǎn)錄酶為靶點；②以鳥嘌呤四聯(lián)體為靶點；③染色體轉(zhuǎn)移和細胞融合的方法；④以小分子逆轉(zhuǎn)錄酶為靶點。
抗腫瘤治療以端粒酶為靶點，主要通過以下方法：①核酶：核酶[5]是一種具有核酸內(nèi)切酶催化活性的反義RNA，其與RNA結(jié)合時可以以序列特異性方式，同時對RNA進行切割，從而使具有的生物學功能市區(qū)；②基因療法：反義核苷酸是根據(jù)端粒酶RNA模板序列而進行設(shè)計，其可通過對模板作用進行阻斷，從而達到對端粒酶合成端粒序列進行抑制的目的，如Geron公司研發(fā)生產(chǎn)的GRN163L（Imetelstat），其正屬于一種小分子端粒酶抑制劑，它是一種脂肪修飾的13寡聚核苷酸N3'P5'噻替哌，通過與模板端粒酶RNA（hTR）之間的互補，目前臨床中ⅢB和Ⅳ期的非小細胞肺癌采用該藥與紫杉醇/卡鉑聯(lián)合用藥進行治療的試驗已進入Ⅱ期；③誘導分化藥物[6]：端粒酶活性在正常細胞向成熟體細胞分化后會受到抑制，但是當細胞發(fā)生癌變后，其活性則被重新激活，通過此可提示端粒酶的活性可能受到誘導分化的抑制；④逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：端粒酶屬于一種逆轉(zhuǎn)錄酶，因此端粒酶活性能夠受到逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑抑制，這為端粒抑制劑的設(shè)計提供了新的研究思路。
但在其靶向研究中尚存在許多有待解決的問題[7]：①腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是由于多因素、多途徑引發(fā)的，端粒酶活性通過反義寡聚核苷酸來進行抑制，可能會使其他非端粒酶途徑受到激活，從而導致腫瘤對此方法產(chǎn)生耐受；②由于采用反義寡聚核苷酸需要大劑量且反復使用，同時加之對其化學修飾，從而導致其對組織和正常細胞的毒副作用難以控制；③端粒酶在人體某些組織干細胞、生殖干細胞、造血干細胞都有表達，端粒酶抑制劑如果作用于腫瘤細胞是否會對這些細胞產(chǎn)生毒性。
2 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methytransferase，DNMT）是生物有機體內(nèi)普遍存在的一種重要酶類，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，將其甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸（CpG islands）的胞嘧啶5位碳原子上的過程，在基因表達及動物生長、發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用；同時，又能催化多種生理過程中間產(chǎn)物的甲基化進而合成或降解生理活性物質(zhì)[8]。在細胞的分裂與分化中甲基轉(zhuǎn)移復合酶占據(jù)著重要地位，一旦其發(fā)生異常，則會細胞的分裂與分化造成重大的決定性影響，而癌癥則正是由于這些酶發(fā)生異常而引發(fā)的結(jié)果。復制母細胞DNA的甲基分布是正常的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶所具有的只要功能，但是在發(fā)生癌變的細胞中，其DNA甲基轉(zhuǎn)移酶由于活性異?；钴S，由此新增的過度甲基化隨處可見，而過度甲基則通常是導致DNA修復酶基因和抑癌基因無法表達的原因，或者就成為突變發(fā)生的熱點；異常DNA甲基轉(zhuǎn)移復合酶也有可能使導致基因擴增的原因，而若為多藥耐藥基因為擴張的基因，由此則導致癌細胞具有多藥耐藥的危險。因此，異常甲基轉(zhuǎn)移復合酶在癌細胞的惡化和耐藥的形成與異常具有重要影響作用。如果用細胞毒藥物對DNA的合成進行抑制，則會導致DNA的過度甲基化變得更為嚴重，由此而引發(fā)的后果也更為頻繁[9]。
2.1甲基轉(zhuǎn)移復合酶的作用機制 甲基轉(zhuǎn)移復合酶是由MAT-MT-SAHH三成員構(gòu)成。外來的促進因素能夠?qū)φ＜毎谆D(zhuǎn)移復合酶的活性進行完全控制，如選用固醇激素靶細胞，其受體是SAHH，當存在固醇激素時，固醇激素首先結(jié)合的是SAHH，然后促使SAHH與MT結(jié)合成雙酶體，最后MAT再與雙酶體二者發(fā)生結(jié)合成為三酶體。三酶體的結(jié)合中甲硫丁氨酸與ATP起到有效的結(jié)合作用，通過這三種酶共同所結(jié)合而成的復合酶才能夠使甲基轉(zhuǎn)移的活性得到有效發(fā)揮，由此使酶的穩(wěn)定得到有效保證（如圖1）。固醇激素的周期性高低在正常生理調(diào)節(jié)下，結(jié)果是激素靶的干細胞轉(zhuǎn)動于分裂與分化之間，但若固醇激素消失，則MT-SAHH雙酶體也會分離，，MT成單時則變得很不穩(wěn)定，會受到蛋白酶的立即分解，從而轉(zhuǎn)變?yōu)楹怂岱纸饷?，由此而導致細胞受到傷害而凋亡，核酸分解酶本身也有可能是參與細胞凋亡的因素。總之，正常細胞的分裂、分化和凋亡完全操控于外來的生長素。
2.2 甲基轉(zhuǎn)移復合酶與腫瘤 癌細胞自行產(chǎn)生一特異癌蛋白質(zhì)與MAT和SAHH結(jié)合時發(fā)生癌細胞甲基轉(zhuǎn)移復合酶的異常，其結(jié)果會導致復合酶活性特別強，并非常未定，由此癌細胞的調(diào)節(jié)分化功能則丟失。細胞若想發(fā)生分解則必須具有缺鉀基核酸的合成，使與分化有關(guān)的基因能夠得以表達。特異癌蛋白質(zhì)與MAT和SAHH發(fā)生結(jié)合以后會導致酶的動力性質(zhì)發(fā)生改變。所有可以讓異常甲基轉(zhuǎn)移復合酶恢復正常酶的動力性質(zhì)的化學物質(zhì)均屬于很好的分化誘導劑。有效調(diào)節(jié)復合酶活性和穩(wěn)定性是特異性癌蛋白所存在的主要功能。研究發(fā)現(xiàn)，異癌蛋白質(zhì)的功能通過分化誘導劑抵消中采用MAT的競爭性抑制劑具有重要作用，因此MAT的競爭性抑制劑也叫分化幫助劑。很顯然，SAHH的競爭性抑制劑也具有同樣的功效。雖然甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑其本身并不屬于很好的分化誘導劑，但通過這些抑制劑的幫助，能夠?qū)S甲酸的誘導分化起到很強的促進作用。相比兩種單獨用藥，采用這種促進作用效果更高，是一種協(xié)同作用。
2.3 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 已發(fā)現(xiàn)的DNMT有以下5種：DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L，其中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b這3種與NA甲基化存在著密切聯(lián)系。DNMT1主要功效是對現(xiàn)存于體內(nèi)的DNA甲基化模式進行維持，即在新合成的螺旋蛋白上復制母體的DNA甲基化模式，而DNMT3a和DNMT3b則可能是胚胎的早期發(fā)育過程中建立起DNA甲基化的模式。雖然目前對于這些酶的生物機制仍然不是完全清楚，但是這些酶在大部分的腫瘤細胞中均存在著異常過度表達。因此，通過對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的抑制，通過對DNA的高度甲基化的阻斷來將腫瘤細胞進行抑制或殺死，這一思路，在科研工作者中已經(jīng)收到越來越多的重視，在藥物化學研究中對于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的研究已成為目前的一個研究熱點。目前，較多的DNMT抑制劑正在研究開發(fā)，其化學結(jié)構(gòu)主要分為核苷及非核苷兩大類。核苷類似物主要主要包含阿扎胞苷的脫氧核糖類似物和胞嘧啶核苷衍生物。在DNA復制過程中核苷類DNMT抑制劑可以摻入DNA，然后受到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識別，通過與DNMT半胱氨酸殘基上的巰基共價結(jié)合由此而達到使酶失活的目的。因核苷類DNMT抑制劑存在著固有的細胞毒作用，而非共價結(jié)合的非核苷類DNMT抑制劑具有較高的特異性，能夠?qū)NMT的活性部位進行直接阻斷，由此使核苷類DNMT抑制劑與酶二者之間的共價結(jié)合所引起的的毒副作用得到有效避免。因此，目前非核苷類DNMT抑制劑的開發(fā)是人們研究的重點。
3 缺氧誘導因子
腫瘤組織大部分區(qū)域氧濃度由于受到新生血管不規(guī)則和腫瘤組織生長迅速等因素的影響，相比正常組織氧濃度而言更為低，即處于缺氧狀態(tài)。缺氧是包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的重要特征，與腫瘤遷移、良性腫瘤向惡性腫瘤進展、腫瘤耐受化療和放療等有著密切聯(lián)系，造成患者治療難度進一步增加，預后效果差。近年來，通過對腫瘤細胞的缺氧環(huán)境有效的利用，有選擇性的進行殺滅和抑制其生長，是治療的新思路。
缺氧誘導因子（HIF），在缺氧誘導的哺乳動物細胞中廣泛表達，為缺氧應答的全局性調(diào)控因子。HIF有3種亞型，分別是HIF-1、HIF-2及HIF-3，且HIF-1、HIF-2和HIF-3含有相同的HIF-1β亞基，是均具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋。HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α是HIF的功能亞基，具有生物活性，均含有獨特的氧依賴降解區(qū)（ODDD），是惟一可接受氧濃度變化調(diào)控的亞單位，決定著HIF的活性。
3.1 HIF-1與腫瘤 HIF-1是真核細胞在缺氧條件下進行代謝調(diào)控的關(guān)鍵因子，控制眾多基因的表達，影響氧的轉(zhuǎn)運、糖攝取、糖酵解和血管生成，促進腫瘤細胞在缺氧條件下生長、遷移等。HIF-1還可以通過激活B細胞慢性淋巴性白細胞/淋巴瘤家族成員如BCL 2等的轉(zhuǎn)錄或增加p53基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性，最終誘導細胞凋亡[10]。下調(diào)HIF-1水平可以作為腫瘤治療手段。由于細胞內(nèi)對HIF-1的調(diào)控主要通過其α亞基進行，因此HIF-1α抑制劑成為抗腫瘤藥物的研究熱點。
3.2 HIF-1α抑制劑 近年來作用于HIF-1通路不同位點上的抑制劑大部分已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。這些抑制劑具有的共同點是能夠使細胞內(nèi)HIF-1α水平得到降低，對HIF-1所調(diào)控的基因的表達進行有效抑制，如VEGF（血管內(nèi)皮生長因子），在動物模型中可以阻礙腫瘤細胞的生長。在抗腫瘤治療中采用腫瘤缺氧的微環(huán)境，由于其容易產(chǎn)生放化療耐受性，因此治療效果較差。而根據(jù)二者之間存在的氧濃度差異，有可能有較好選擇性的藥物能夠得到開發(fā)[10]。但是，HIF-1的研究目前仍然處于起始階段，由于其能夠?qū)δ[瘤發(fā)生、侵襲、存活、耐藥性等方面起到有效的作用，因此HIF-1有希望可以在抗腫瘤化學治療中成為新一代的藥物靶點。
4 基質(zhì)金屬蛋白酶
4.1 基質(zhì)金屬蛋白酶與腫瘤 癌細胞通過局部腫瘤生長并轉(zhuǎn)移到體內(nèi)的不同組織器官而損害人體。腫瘤轉(zhuǎn)移的過程從破壞基底膜開始，癌細胞穿越基底膜和細胞外基質(zhì)（ECM）的間質(zhì)進入體循環(huán)；穿透其他組織的血管壁內(nèi)皮細胞，并再次侵入基底膜，增生為新的腫瘤；同時補充生成新血管以維持其進一步增殖。組織間隙的基質(zhì)含有許多蛋白質(zhì)：膠原蛋白、蛋白多糖、明膠、層粘連蛋白和纖維結(jié)合素等。涉及降解作用的酶有絲氨酸蛋白酶、氨基丁二?；鞍酌?、半胱氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬酶（MMP）。
基質(zhì)金屬酶（MMP），是一類能水解細胞外基質(zhì)的蛋白裂解酶，細胞外基質(zhì)中各種蛋白成分幾乎都能夠受到其降解，使腫瘤細胞侵襲的組織學屏障受到破壞，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中具有至關(guān)重要的作用。
在癌癥的生物學行為中，MMPs具有關(guān)鍵性作用。其造成癌細胞發(fā)生增長及擴散主要可分為下面3個過程：①發(fā)?。篗MPs使健康組織的基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生分解，從而使腫瘤發(fā)生增生。②轉(zhuǎn)移：MMPs能夠造成組織結(jié)構(gòu)松弛，從而更利于癌細胞轉(zhuǎn)移，同時組織的自我分解液使MMPs釋放得到進一步促進，從而進一步導致腫瘤增生的發(fā)生；③血管生成：MMPs在胞外基質(zhì)降解的同時能夠有效的幫助新血管生長，為其提供必需的空間。
4.2 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 MMPs抑制劑主要包含天然和人工合成兩大類；天然抑制劑有金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP） 和α-巨球蛋白（α-macroglobulin） 。其中前者研究較多。而人工合成抑制劑由于其具有可批量生產(chǎn)，同時能夠?qū)δ[瘤侵襲和轉(zhuǎn)移進行有效抑制的優(yōu)點，目前在抗癌藥物的研究中已經(jīng)成為一個新熱點。最早合成并應用于臨床試驗的MMPs 抑制劑是由國生物技術(shù)公司開發(fā)的Batimastat （BB-94），其分子量為474，是一種異羥肟酸衍生物，其與作用底物肽鏈具有相似結(jié)構(gòu)，能夠?qū)Χ喾NMMPs 活性進行顯著抑制。BB-94不僅可以對轉(zhuǎn)移灶的克隆形成進行有效抑制，同時對于原位實體瘤的生成也能夠有效限制，這一作用與該化合物抑制腫瘤細胞利用金屬蛋白酶進行侵襲性生長和抑制腫瘤的血管生成有關(guān)。MMPs抑制劑正被開發(fā)為一種新型的抗腫瘤血管生成劑，如英國生物技術(shù)公司開發(fā)的Batimastat（BB-94）以及Entremed 公司的Endostatin、angiostatin均已經(jīng)受到公眾注意，預計MMPs 抑制劑與多種標準的癌癥療法結(jié)合使用將比僅使用單一制劑更為有效。
5 多靶點藥物
隨著蛋白質(zhì)組學（proteomics）和基因組學（genomics）等學科的發(fā)展，人們對于藥物在體內(nèi)作用機制的認識已逐漸從細胞水平深入到分子水平。許多選擇性作用于特殊靶點的藥物也不斷被發(fā)現(xiàn)。但對于某些復雜疾病如癌癥、高血壓等，單一靶點的藥物通常很難達到預期治療效果甚至會出現(xiàn)不良反應，而將幾種不同單一靶點藥物聯(lián)用或選擇使用作用于多個分子靶標的"多靶點"藥物治療復雜疾病時則會有較佳療效。
多靶點藥物的研究尤其適用于腫瘤治療。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由多基因參與的多步驟、多階段、體內(nèi)外因素相互作用的復雜過程，且多數(shù)腫瘤有4～7個獨立的突變位點，因此需要多靶點治療來確保藥物抗腫瘤作用的有效性和持久性。
6 結(jié)語
端粒酶活性是惡性腫瘤的一種標志，也是一個有用的靶點，以端粒酶為靶點的抗腫瘤治療主要有四種；癌細胞異癌蛋白質(zhì)與甲基復合酶結(jié)合，使復合酶變成非常穩(wěn)定、活性特別強，能夠使異常甲基轉(zhuǎn)移復合酶恢復正常酶的動力性質(zhì)的化學物質(zhì)都可以很好的誘導癌細胞分化；缺氧誘導因子抑制劑可以降低細胞內(nèi)HIF-1α水平，抑制HIF-1所調(diào)控的基因的表達，如VEGF（血管內(nèi)皮生長因子），從而阻礙腫瘤細胞的生長；基質(zhì)金屬酶能降解細胞外基質(zhì)中各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，另外多靶點藥物的研究尤其適用于腫瘤治療，能確保藥物抗腫瘤作用的有效性和持久性。
全球抗腫瘤靶向小分子化學藥物是進入新世紀后上市的品種，其作用機制、多靶點的擴展和安全性仍在臨床探索之中。相信隨著對各種重大疾病的深入認識，隨著醫(yī)藥科學的不斷發(fā)展，以后會有越來越多的靶點被發(fā)現(xiàn)，加速靶向藥物的發(fā)展，為腫瘤的治療提供新的途徑，抗腫瘤藥物的新靶點研究前景將變得更加寬廣，開發(fā)出效果更好的抗腫瘤新藥，使人類征服癌癥不再遙不可及，不再是天方夜譚。
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