序論：在您撰寫干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)時，參考他人的優(yōu)秀作品可以開闊視野，小編為您整理的7篇范文，希望這些建議能夠激發(fā)您的創(chuàng)作熱情，引導(dǎo)您走向新的創(chuàng)作高度。

第1篇

【關(guān)鍵詞】 表皮干細(xì)胞; 細(xì)胞培養(yǎng); 細(xì)胞傳代

近年來，人類組織干細(xì)胞的研究已成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點，表皮干細(xì)胞即是其中之一。表皮干細(xì)胞是一種在成年期還能維持較高的自我更新能力的細(xì)胞群，在正常狀態(tài)下維持表皮的自我更新，當(dāng)受到損傷刺激時，表皮干細(xì)胞可以參與皮膚損傷的修復(fù)[1]。隨著人口老齡化速度加快，慢性潰瘍及皮膚病患者日益增多，加之燒傷及意外創(chuàng)傷造成的皮膚缺損，臨床對皮膚移植的需求越來越大。由于表皮干細(xì)胞數(shù)量少，缺乏明確的特異性分子標(biāo)志，體外培養(yǎng)很容易丟失其干細(xì)胞生物學(xué)特性，增加了分離培養(yǎng)的難度。獲得大量高純度的表皮干細(xì)胞成為該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵技術(shù)。我們根據(jù)幾年來在細(xì)胞培養(yǎng)方面的工作實踐，將人表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)總結(jié)如下。

1 人表皮干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

應(yīng)用IV型膠原快速粘附法從手術(shù)切除的人包皮組織中分離表皮細(xì)胞中的快速粘附細(xì)胞，這一群細(xì)胞被認(rèn)為是表皮干細(xì)胞，它具有快速粘附、緩慢生長的特點[2]。取年齡在5～25歲無泌尿系統(tǒng)感染患者的包皮皮片，無菌條件下去除皮下脂肪層，用含青霉素、鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗皮片數(shù)次，修剪成大小約0.5 cm×0.5 cm的皮片，置于培養(yǎng)皿中，加入0.25%中性蛋白酶10 ml，4℃消化l4～16 h，吸棄上清，分離表皮和真皮層。剪碎表皮，用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，37℃，10 min，加入含有10%胎牛血清的DMEM終止消化，反復(fù)吹吸至細(xì)胞懸浮，200目篩網(wǎng)研磨過濾。濾液經(jīng)1 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞。加入表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基(每100 ml KSFM培養(yǎng)基加入0.05 mmol氯化鈣100 μl、HKGS添加劑1 ml)并輕柔吹打制成單細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先鋪有Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶中，37℃孵育15 min。倒置鏡下觀察，粘附在Ⅳ型膠原被膜上的細(xì)胞為表皮干細(xì)胞，吸出細(xì)胞懸液，用DHank’s液洗2次，加入表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d換液1次，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長，2～3 d內(nèi)細(xì)胞開始分裂，4～5 d后會出現(xiàn)許多細(xì)胞克隆或集落。培養(yǎng)基中鈣離子的濃度是保持人表皮干細(xì)胞既增殖又不分化的關(guān)鍵。鈣離子濃度過低，會導(dǎo)致所培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞生長緩慢或不生長;若鈣離子濃度過高，則加速了細(xì)胞分化。我們在實驗中篩選出適合的培養(yǎng)基中鈣離子濃度，可以保證有效的培養(yǎng)維持。在培養(yǎng)過程中，還要經(jīng)常檢查培養(yǎng)箱溫度和CO2的濃度，過低或過高的溫度和CO2含量都影響人表皮干細(xì)胞的生長，容易出現(xiàn)細(xì)胞老化和衰退現(xiàn)象。為了避免各種細(xì)菌、真菌污染培養(yǎng)箱，每周用75%的酒精擦洗箱內(nèi)的托盤、格架、箱壁。托盤始終裝有一定量的飽和濃度磷酸氫二鈉(Na2HPO4)液體，細(xì)菌既不能在其中生長，也能提供合適的濕度[3]。

2 人表皮干細(xì)胞的傳代

當(dāng)原代細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時，需進(jìn)行傳代，否則細(xì)胞會沒有足夠的生長空間，也會因為營養(yǎng)耗竭而影響生長[4]。用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞，置37℃溫育5 min，必須經(jīng)常在顯微鏡下觀察細(xì)胞被消化的情況，若細(xì)胞部分漂浮起來，即可終止消化。加入2 ml終止液，用吸管反復(fù)輕輕吹打貼壁細(xì)胞，使其形成細(xì)胞懸液，按1∶2傳代。傳代細(xì)胞接種于IV型膠原預(yù)鋪的培養(yǎng)瓶中。

3 人表皮干細(xì)胞的凍存

細(xì)胞不用或保種時，可將細(xì)胞冷凍保存在液氮中。細(xì)胞在培養(yǎng)基中直接降溫冷凍，可因細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境中的水而形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列變化，如機(jī)械損傷、滲透壓改變、蛋白變性等，從而引起細(xì)胞死亡。因此，細(xì)胞培養(yǎng)基中要加入保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油。為保持細(xì)胞最大存活率，凍存時要遵循“慢凍快融”的原則。一般用第2代人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞配成5×106 /ml 的細(xì)胞懸液，1 000轉(zhuǎn)/min，離心10 min，棄去上清，加入1～2 ml 含有10%DMSO的凍存液，用吸管小心吹打，重新懸浮細(xì)胞，分裝于2 ml凍存管中，將蓋擰緊，用記號筆記好細(xì)胞名稱、細(xì)胞代數(shù)、凍存日期、操作人等。放入-70℃冰箱過夜后，再轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。注意：用于凍存的細(xì)胞應(yīng)在光鏡下觀察生長狀態(tài)良好，凍存細(xì)胞的體積不要超過凍存管體積的1/2。

4 人表皮干細(xì)胞的復(fù)蘇

從液氮中取出凍存管后，迅速投入預(yù)先準(zhǔn)備的40～42℃水中，并不時搖動，讓細(xì)胞凍存液快速解凍1 min左右。取出凍存管，用75%酒精擦拭消毒外壁后，吸出細(xì)胞懸液，加至10 ml離心管中，補加含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，小心吹打使細(xì)胞分散懸浮。1 000轉(zhuǎn)/min，低速離心10 min，棄去上清，加入表皮干細(xì)胞用的條件培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后，轉(zhuǎn)入IV型膠原預(yù)鋪的培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2飽和水蒸汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。復(fù)蘇后要每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長至適當(dāng)密度時，及時分瓶培養(yǎng)或?qū)嶒灤谩?/p>

人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速，但諸如細(xì)胞在體外培養(yǎng)容易變形，多次傳代后細(xì)胞克隆形成率明顯下降，細(xì)胞逐漸分化難以保持原代細(xì)胞特性等問題，還有待更好地解決。

參考文獻(xiàn)

1 Michel M，Torok N，Godbout MJ，et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites，and their number varies with donor age and culture stage.J Cell Sci，1996，109 (Pt 5): 10171028.

2 Kim DS，Cho HJ，Choi HR，et al.Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents.Cell Mol Life Sci，2004，61(21): 27742781.

第2篇

目的： 利用簡化無血清培養(yǎng)基和連續(xù)傳代法，從成體小鼠腸管分離培養(yǎng)腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞(GNCSCs)，觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中增殖、分化的特點. 用p75， GFAP，Peripherin，αActin作為特異性標(biāo)志來鑒定GNCSCs及其分化的細(xì)胞系. 方法： 將新生1， 5 d的小鼠腸管制成單細(xì)胞懸液，接種于無血清DMEM/F12完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)并觀察克隆球的形成過程. 將克隆球接種于含血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，觀察其分化現(xiàn)象. 用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光法檢測克隆球及其分化細(xì)胞系特異性標(biāo)志物的表達(dá). 結(jié)果： 成體小鼠腸管中有少數(shù)細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清誘導(dǎo)下可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞. 結(jié)論： 成體腸管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在體外GNCSCs可分化為腸神經(jīng)系統(tǒng)所必須的細(xì)胞類型.

【關(guān)鍵詞】 腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞 小鼠 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞分化 Hirschsprung病

0引言

應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞治療某些神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和退行性疾病，經(jīng)過較長時間的實踐已被證明是行之有效的［1］. 腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神經(jīng)管背側(cè)，具有干細(xì)胞特性［2］，將其用于治療先天性巨結(jié)腸癥及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞疾病的研究已引起人們的關(guān)注，本實驗著重進(jìn)行GNCSCs的基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用建立理論基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，體質(zhì)量不拘，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供. ① DMEM/F12完全培養(yǎng)基（Gibco）組成：B27添加劑（Gibco），N2添加劑（Gibco），重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF， vitrogen)， β巰基乙醇（Sigma），青霉素和鏈霉素（華北制藥）. ② 促分化培養(yǎng)基組成：DMEM/F12完全培養(yǎng)基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ膠原酶（Sigma），左旋多聚賴氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武漢博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗體(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗體（DAKO），鼠抗小鼠αActin單克隆抗體（Sigma）SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗為TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉).

1.2方法

1.2.1取材、克隆球的培養(yǎng)頸椎脫臼法處死2組小鼠，將其腸管放入Hanks，清洗，機(jī)械分散腸管組織，胰蛋白酶和Ⅳ膠原酶分別消化腸管組織30 min，10 min，終止消化后反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，用200目，400目的濾網(wǎng)過濾，以800 r/min 離心 5 min，棄上清，用預(yù)先配置的無血清完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞，以 6×108個/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中水平放置，貼壁培養(yǎng). 原代孵育24 h后棄去漂浮的死細(xì)胞，以2/3量換液，孵育3 d后進(jìn)行傳代，以6×108個/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)孵育40~48 h后再次傳代，如有細(xì)胞團(tuán)塊形成則以1代/1~2 d的速度傳代，3代之后可形成圓形的克隆球.

1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸傳代5次后的克隆球，接種于放置有預(yù)先包被左旋多聚賴氨酸蓋玻片的35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿2 mL，動態(tài)觀察克隆球的分化情況.

1.2.3克隆球及其分化細(xì)胞特異性標(biāo)志物的染色應(yīng)用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗體分別檢測克隆球及其分化細(xì)胞系的性質(zhì)，封片后分別用光學(xué)顯微鏡和激光共焦顯微鏡取圖.

轉(zhuǎn)貼于

2結(jié)果

2.1克隆球的生長狀況接種初期，倒置顯微鏡下觀察到單細(xì)胞和一些呈半球狀或不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán). 孵育24 h后，貼壁細(xì)胞胞呈圓形，胞體小，折光性好，部分貼壁細(xì)胞胞體增大，折光性增強，出現(xiàn)分裂相，形成2～5個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，另一部分呈聚集生長. 3 d后形成十幾或數(shù)十個細(xì)胞構(gòu)成的克隆球(圖1A)，克隆球增大的同時向周圍伸出放射狀的細(xì)胞索，形成較小的次級克隆，這些克隆球形態(tài)完整，折光性減弱，周邊界線清晰，但其中心密集，界限不清，無法觀察到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu) （圖1B）. 重新傳代培養(yǎng)，可觀察到細(xì)胞胞體增大，出現(xiàn)分裂相的克隆球數(shù)量逐漸增多，雜質(zhì)細(xì)胞減少，在連續(xù)傳代過程中克隆球逐漸純化.

2.2克隆球的分化接種含血清培養(yǎng)基12 h后，可見有細(xì)胞從克隆球中遷出，遷出的細(xì)胞貼壁生長；24 h后克隆球變扁，遷移出的細(xì)胞增多，相差顯微鏡下難以分別形態(tài)；48 h后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加，逐漸形成單細(xì)胞層且細(xì)胞形態(tài)多元化.

2.3克隆球及其分化細(xì)胞系的免疫染色免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（圖1C，圖2， 3）.

3討論

許多研究表明GNCSCs在ENS的發(fā)生和發(fā)育起關(guān)鍵作用［3-4］. 目前HSCR的病因與RET等8種基因密切相關(guān)［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、遷徙及分化等功能發(fā)生障礙，受累腸道的相應(yīng)神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)缺失，表明先天性巨結(jié)腸可能是一種干細(xì)胞疾病. 由于HSCR及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞性疾病在手術(shù)治療后仍遺留有嚴(yán)重的并發(fā)癥，因此用干細(xì)胞來進(jìn)行臨床治療已成為研究的熱點和重點. 鑒于胚胎干細(xì)胞的來源限制及免疫排斥問題，成體GNCSCs的研究將為今后的移植試驗提供新契機(jī).

GNCSCs的培養(yǎng)方法建立在中樞神經(jīng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上. 依據(jù)神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)典的培養(yǎng)方法，再結(jié)合GNCSCs“收獲率”低、難以分離純化的特點，聯(lián)合應(yīng)用簡化的特殊培養(yǎng)劑和神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行體外培養(yǎng). 連續(xù)傳10代后，GNCSCs的相對比例明顯增加，這種體外培養(yǎng)的方法能有效地分離和純化GNCSCs，但并不能完全消除其他細(xì)胞. 如果繼續(xù)傳代，其純化程度越高，后續(xù)的試驗效果將更佳. 連續(xù)傳代不僅純化了GNCSCs，還證實了干細(xì)胞的自我更新特性. 在體外培養(yǎng)干細(xì)胞時，培養(yǎng)條件稍有變化可導(dǎo)致分化機(jī)制的啟動，因此采用血清促分化法誘導(dǎo)GNCSCs分化既簡單又可靠. 通過免疫染色，證實了GNCSCs分化細(xì)胞的類型，同時顯示了分化的亞型神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，并表明了成體干細(xì)胞的多向分化能力.

參考文獻(xiàn)

［1］ 楊帆，楊樹源. 神經(jīng)干細(xì)胞研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用前景［J］.醫(yī)學(xué)綜述， 2002；8(8):491-493.

［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.

［3］ Natarajan D， Grigoriou M， MarcosGutierrez CV， et al. Multipotential progenitors of the mammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture［J］. Development 1999， 126(1):157-168.

第3篇

關(guān)鍵詞：  大鼠 肌源性干細(xì)胞 體外培養(yǎng)

    近年研究發(fā)現(xiàn)，成體骨骼肌中不但存在單能的成肌干細(xì)胞－衛(wèi)星細(xì)胞，而且還含有多能的“肌源性干細(xì)胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干細(xì)胞起源于胚胎血管祖細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中，可分化為血細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等不同胚層的組織細(xì)胞，MDSCs的表面標(biāo)志已被初步認(rèn)識，對其分化的研究，及其分離純化的技術(shù)研究正在進(jìn)一步深入 ［1-3］。本實驗經(jīng)過技術(shù)改良，通過體外原代培養(yǎng)獲得高純度MDSCs，為組織工程的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1  材料與方法

    1.1  材料  I型膠原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及鏈霉素(國產(chǎn))。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（異硫氰酸熒光黃）(武漢博士德)。

    1.2  原代MDSCs的取材、分離純化  參照參考文獻(xiàn)所報道的方法［4，5］ ，選用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的醫(yī)用酒精中，5 min×3次，處死并消毒；無菌條件下取前肢肱三頭肌，后肢腓腸肌，盡可能剔除脂肪、肌腱等結(jié)締組織：用PBS液漂洗2次，將肌組織移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜狀；加入1%的Ⅰ型膠原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍體積的胎牛血清中止消化，反復(fù)吹打后濾過200目的篩網(wǎng)，收集濾液，1 000 r/ min離心7 min，室溫靜置5 min棄上層液，細(xì)胞團(tuán)塊用生長培養(yǎng)基(含20%胎牛血清的DMEM)重懸，移入培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶稱為PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置過夜，隨后將懸液轉(zhuǎn)移到另一個膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，此為PP2。此后連續(xù)4 d每隔24 h將懸液離心、重懸后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，分別為PP3～PP6。PP1～PP5棄去不用，PP6用于進(jìn)一步的鑒定實驗，細(xì)胞在達(dá)到約70%匯合時必須傳代。

    1.3  MDSCs生長曲線的繪制  取PP6傳至第2代細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104個／孔接種于24孔培養(yǎng)板。每日取3孔消化后，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，共7日根據(jù)記數(shù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線。

     2008年2月，29(1)1.4  MDSCs的免疫熒光鑒定  取PP6中的MDSCs培養(yǎng)到第3代時，把細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中的蓋玻片上，第5 d細(xì)胞生長達(dá)70%～80%匯合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封閉液，常溫下靜置1 h，封閉非特異性結(jié)合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，照相。

    2  結(jié)    果

    2.1  分離細(xì)胞的形態(tài)、生長特性  PP1、PP2（圖1A）貼壁細(xì)胞相對較少，大部分是長梭形的成纖維樣細(xì)胞，其余是寬大而呈星形或不規(guī)則的雜細(xì)胞，增殖較快，1周左右即可完全融合。PP3（圖1B）開始即有少量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞較少。隨著純化的繼續(xù)，圓形或短梭形細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，到PP6（圖1C）時超過80%，這些細(xì)胞貼壁后絕大多數(shù)為梭形或紡錘形， 有兩極， 體積小， 胞核折光性強。少數(shù)細(xì)胞呈多角形， 有突起。隨培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞增殖、遷移逐漸形成規(guī)律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，若不加以控制及時傳代，細(xì)胞可迅速融合成細(xì)胞鏈或聚成團(tuán)塊生長，細(xì)胞增殖速度減慢， 細(xì)胞相互融合， 形成肌小管（圖1D）。圖1A  PP1、PP2貼壁細(xì)胞相對較少，大部分是長梭形的成纖維樣細(xì)胞和寬大而呈星形或不規(guī)則的雜細(xì)胞×200 

    圖1B  PP3有少量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞較少×200

    圖1C  PP6圓形或短梭形細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，超過80% ×200

    圖1D  細(xì)胞增殖、遷移逐漸形成規(guī)律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，細(xì)胞增殖速度減慢，×200

    圖1E、F  細(xì)胞特異性desmin染色呈陽性，熒光顯微鏡可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光×400

    2.2  生長曲線  第2日開始進(jìn)入對數(shù)生長期，第5日后由于接觸抑制，增殖速度減慢(圖2)。圖2  傳代MDSCs的生長曲線

    2.3  對PP6的細(xì)胞表型鑒定  肌源性干細(xì)胞本身具有特征性的外形， 其胞漿中含有結(jié)蛋白(desmin) 可通過細(xì)胞免疫熒光方法鑒定。本實驗采用小鼠抗大鼠desmin一抗對肌源性干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，細(xì)胞質(zhì)desmin染色陽性（圖1E，1F），細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光。觀察500個細(xì)胞，90%為desmin陽性。

3  討    論

第4篇

【關(guān)鍵詞】 大鼠 肌源性干細(xì)胞 體外培養(yǎng)

Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods

By two-step method， the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin， and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells was analysed through studying growth curve， and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions

MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.

Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro

近年研究發(fā)現(xiàn)，成體骨骼肌中不但存在單能的成肌干細(xì)胞－衛(wèi)星細(xì)胞，而且還含有多能的“肌源性干細(xì)胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干細(xì)胞起源于胚胎血管祖細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中，可分化為血細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等不同胚層的組織細(xì)胞，MDSCs的表面標(biāo)志已被初步認(rèn)識，對其分化的研究，及其分離純化的技術(shù)研究正在進(jìn)一步深入 ［1-3］。本實驗經(jīng)過技術(shù)改良，通過體外原代培養(yǎng)獲得高純度MDSCs，為組織工程的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 I型膠原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及鏈霉素(國產(chǎn))。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（異硫氰酸熒光黃）(武漢博士德)。

1.2 原代MDSCs的取材、分離純化 參照參考文獻(xiàn)所報道的方法［4，5］ ，選用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的醫(yī)用酒精中，5 min×3次，處死并消毒；無菌條件下取前肢肱三頭肌，后肢腓腸肌，盡可能剔除脂肪、肌腱等結(jié)締組織：用PBS液漂洗2次，將肌組織移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜狀；加入1%的Ⅰ型膠原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍體積的胎牛血清中止消化，反復(fù)吹打后濾過200目的篩網(wǎng)，收集濾液，1 000 r/ min離心7 min，室溫靜置5 min棄上層液，細(xì)胞團(tuán)塊用生長培養(yǎng)基(含20%胎牛血清的DMEM)重懸，移入培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶稱為PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置過夜，隨后將懸液轉(zhuǎn)移到另一個膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，此為PP2。此后連續(xù)4 d每隔24 h將懸液離心、重懸后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，分別為PP3～PP6。PP1～PP5棄去不用，PP6用于進(jìn)一步的鑒定實驗，細(xì)胞在達(dá)到約70%匯合時必須傳代。

1.3 MDSCs生長曲線的繪制 取PP6傳至第2代細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104個／孔接種于24孔培養(yǎng)板。每日取3孔消化后，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，共7日根據(jù)記數(shù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線。

2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫熒光鑒定 取PP6中的MDSCs培養(yǎng)到第3代時，把細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中的蓋玻片上，第5 d細(xì)胞生長達(dá)70%～80%匯合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封閉液，常溫下靜置1 h，封閉非特異性結(jié)合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，照相。

2 結(jié)

果

2.1 分離細(xì)胞的形態(tài)、生長特性 PP1、PP2（圖1A）貼壁細(xì)胞相對較少，大部分是長梭形的成纖維樣細(xì)胞，其余是寬大而呈星形或不規(guī)則的雜細(xì)胞，增殖較快，1周左右即可完全融合。PP3（圖1B）開始即有少量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞較少。隨著純化的繼續(xù)，圓形或短梭形細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，到PP6（圖1C）時超過80%，這些細(xì)胞貼壁后絕大多數(shù)為梭形或紡錘形， 有兩極， 體積小， 胞核折光性強。少數(shù)細(xì)胞呈多角形， 有突起。隨培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞增殖、遷移逐漸形成規(guī)律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，若不加以控制及時傳代，細(xì)胞可迅速融合成細(xì)胞鏈或聚成團(tuán)塊生長，細(xì)胞增殖速度減慢， 細(xì)胞相互融合， 形成肌小管（圖1D）。圖1A PP1、PP2貼壁細(xì)胞相對較少，大部分是長梭形的成纖維樣細(xì)胞和寬大而呈星形或不規(guī)則的雜細(xì)胞×200

圖1B PP3有少量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞較少×200

圖1C PP6圓形或短梭形細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，超過80% ×200

圖1D 細(xì)胞增殖、遷移逐漸形成規(guī)律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，細(xì)胞增殖速度減慢，×200

圖1E、F 細(xì)胞特異性desmin染色呈陽性，熒光顯微鏡可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光×400

2.2 生長曲線 第2日開始進(jìn)入對數(shù)生長期，第5日后由于接觸抑制，增殖速度減慢(圖2)。圖2 傳代MDSCs的生長曲線

2.3 對PP6的細(xì)胞表型鑒定 肌源性干細(xì)胞本身具有特征性的外形， 其胞漿中含有結(jié)蛋白(desmin) 可通過細(xì)胞免疫熒光方法鑒定。本實驗采用小鼠抗大鼠desmin一抗對肌源性干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，細(xì)胞質(zhì)desmin染色陽性（圖1E，1F），細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光。觀察500個細(xì)胞，90%為desmin陽性。

3 討

論

近年在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)了一群被稱為MDSCs的細(xì)胞群體。預(yù)期它們在組織工程應(yīng)用領(lǐng)域特別是細(xì)胞移植和基因治療方面前景廣闊。國外已在進(jìn)行大量MDSCs介導(dǎo)的相關(guān)的基因治療和組織工程的動物實驗［6-8］，并取得了較明顯的效果。因此建立和完善MDSCs培養(yǎng)方法，獲取高純度的細(xì)胞具有重要實用價值。

骨骼肌細(xì)胞是由胚胎的生肌節(jié)和各處的間充質(zhì)細(xì)胞分化而成，在肌膜和基膜之間有一種體積較小的扁平成立方形細(xì)胞，稱為衛(wèi)星細(xì)胞［9］，是保留在成年骨骼肌內(nèi)具有增殖分化能力的單潛能成肌干細(xì)胞，這種組織特異性的干細(xì)胞在出生后骨骼肌的損傷、修復(fù)和維持中起重要作用。有證據(jù)表明新近發(fā)現(xiàn)的肌源性干細(xì)胞(MDSCs)是一群與衛(wèi)星細(xì)胞完全不同的細(xì)胞群?？赡苁且蝗何聪蛉魏畏较蚨ㄐ偷脑几杉?xì)胞。

lee等［7］31-37從骨骼肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了MDSCs，與衛(wèi)星細(xì)胞相比，其具有更多的分化潛能，不僅能分化成骨骼肌纖維，促進(jìn)肌組織再生，還能分化成成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨骼愈合［5］，被認(rèn)為是衛(wèi)星細(xì)胞的前體。貼壁前的MDSCs呈小而圓的球形，折光性強，剛貼壁仍為圓形，貼壁后的MDSCs呈紡錘形，延遲分瓶時會融合成成熟的多核肌管，這與成纖維細(xì)胞不同。preplate技術(shù)利用差速貼壁獲取MDSCs，其原理是成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的貼壁能力強于衛(wèi)星細(xì)胞，衛(wèi)星細(xì)胞的貼附能力又強于MDSCs，4 d內(nèi)即可完全貼壁而此時MDSCs仍處于懸浮狀態(tài)［6］1085-1100，實驗中發(fā)現(xiàn)，組織塊中加入膠原酶后很快就變成了乳糜狀，胰酶對組織具有很好的離散作用，再通過反復(fù)吹打可將細(xì)胞從基膜中分離出來，得到的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞及MDSCs的混合物，利用差速貼壁法4 d后處于懸浮狀態(tài)的細(xì)胞移出培養(yǎng)即為純化的MDSCs。MDSCs本身具有特征性外形，我們通過結(jié)蛋白desmin染色鑒定其肌源性，通過其多向分化的能力來鑒定其干細(xì)胞特性。實驗中我們還發(fā)現(xiàn)，隨著乳鼠出生天數(shù)的延長，所取得的MDSCs的數(shù)量和活力逐漸下降，但出生時間太短，活力太差，又不利于取材。新出生3～5 d的大鼠最適宜進(jìn)行原代取材。

結(jié)蛋白（desmin）是中間絲蛋白的一種，是成肌分化的早期的標(biāo)志，常作為肌源性的標(biāo)志，雖然成纖維細(xì)胞與骨骼肌內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞也產(chǎn)生結(jié)蛋白，但此細(xì)胞中結(jié)蛋白含量低，與抗體產(chǎn)生弱陽性反應(yīng)，且僅有15％的desmin陽性率［10］，而通過本方法獲取的MDSCs中desmin陽性率高達(dá)90%，由此可進(jìn)行初步鑒別。

MDSCs屬于成體干細(xì)胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活時間長等優(yōu)點，在組織工程和基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。通過對常規(guī)技術(shù)的改良，本研究建立了一種穩(wěn)定高效的新生大鼠MDSCs分離純化技術(shù)，并成功對MDSCs進(jìn)行了鑒定，為MDSCs在基因治療和組織工程的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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第5篇

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞；脂肪組織；細(xì)胞培養(yǎng)；SUI模型

【中圖分類號】R691【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1007-8517(2009)10-0125-01

壓力性尿失禁(SUI)為女性的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率約為1 S%-6O%，多發(fā)生于老年人，因受經(jīng)濟(jì)、宗教、教育程度等因素的影響，其實際發(fā)生率比統(tǒng)計發(fā)病率更高。SVl的癥狀嚴(yán)重與否都不自接危及生命，但它給患者的日常上作、生活及社交活動造成一定程度的影響，甚至?xí)?yán)重影響患者的生活質(zhì)量乃至家庭和睦。

1臨床資料

注射療法是將藥物、化學(xué)制劑或自體組織等注入后尿道或膀肌頸內(nèi)口粘膜下，使尿道腔變窄、拉長，延長功能性尿道的長度，提高尿道阻力，起到關(guān)閉尿道內(nèi)口和后尿道的作用，從而達(dá)到有效控制排尿的口的。這一治療方法對尿道內(nèi)括約肌功能障礙、尿道內(nèi)壓降低同時尿道、膀肌無其他病變等壓力性尿失禁患者有較好的效果。注射療法主要優(yōu)點在于.以在局部浸潤麻醉下進(jìn)行操作，大多數(shù)患者的手術(shù)均.IJ.以在門診進(jìn)行，適用于老年及不能耐一受大手術(shù)的患者。口前注射療法的研究主要集中在選擇不同的注射材料上，理想的注射材料應(yīng)該在結(jié)構(gòu)上完整，無毒、無免疫原性、無變應(yīng)原性，近期內(nèi)不會被分解，能長時間保持其支撐作用?？谇笆褂玫牟牧仙须y達(dá)到上述要求，因此尋找一種取材方便、生物相容性好、安全無毒、療效滿意的注射材料十分必要。

方法：無菌技術(shù)下獲取SD大鼠雙側(cè)腹股溝區(qū)脂肪墊，消化離心，長期培養(yǎng)的方法獲取脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定其表面分子標(biāo)志。SD大鼠24只分為3組，實驗組（6只），對照組一（3只），對照組二（3只）。分別獲取自體ADSCs，實驗組進(jìn)行熒光標(biāo)記。然后實驗組將熒光標(biāo)記的ADSCs自體移植至尿道周圍，對照組移植未并取尿道組織進(jìn)行HE染色組織學(xué)分析。

2結(jié)果

原代培養(yǎng)顯示培養(yǎng)的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞2d左右開始壁,10d-14d左右可達(dá)90%融合,基本上為梭形成纖維樣細(xì)胞形態(tài),免疫細(xì)胞化學(xué)示 CD29陽性，CD34陰性。神經(jīng)切斷術(shù)后10天，除模型組和對照組一各有1只大鼠死亡外，均進(jìn)行尿流動力學(xué)檢測，三組手術(shù)前后ALLP分別為：對照組一為27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，對照二為29.5±4.9和27.4±72.3,模型組為24.8±3.8和14.7±3.0。模型組手術(shù)后ALLP明顯降低，且組織學(xué)檢查亦證明模型組大鼠尿道周圍括約肌明顯萎縮。

3討論

本實驗將熒光金標(biāo)記的脂肪源性干細(xì)胞自體移植至大鼠的近端尿道周圍，行冰凍切片，組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡下觀察.見熒光標(biāo)記的細(xì)胞呈金黃色:后取組抗體免疫移植部位有較多的Desmin陽性的細(xì)胞，棕黃色，部分出現(xiàn)一定的方向性，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，說明己有細(xì)胞在局部存活并生長，提示能成為壓力性尿失禁注射治療的一種理想的注射材料，為將來進(jìn)行細(xì)胞移植治療壓力性尿失禁提供了實驗依據(jù)。

結(jié)論：①大鼠脂肪組織中含有豐富的多能干細(xì)胞。利用消化離心，長期培養(yǎng)的方法可獲取大量的干細(xì)胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周圍成活并生長分化。

參考文獻(xiàn)

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第6篇

【摘要】

目的： 建立胎鼠大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、分化及鑒定的方法，探討神經(jīng)干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性。方法： 取孕14 d胎鼠大腦皮層，吸管吹打機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液，采用無血清培養(yǎng)和胎牛血清誘導(dǎo)分化， 應(yīng)用免疫熒光技術(shù)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞及其分化的子代細(xì)胞。結(jié)果： 從胎鼠大腦皮層分離的細(xì)胞呈神經(jīng)巢蛋白（Nestin）免疫陽性并能在體外傳代培養(yǎng)，血清誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞可表達(dá)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原微管相關(guān)蛋白2和膠質(zhì)纖維酸性蛋白，誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)元能表達(dá)突觸的特異性標(biāo)志Synatophymin。結(jié)論： 分離和培養(yǎng)的細(xì)胞能表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物Nestin，并且具有很強的增殖能力和多向分化潛能，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】 干細(xì)胞 大腦皮質(zhì) 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞分化 胚胎 大鼠 Sprague Dawley

［Abstract］ Objective: To establish a method for isolation， cultivation， differentiation induction， and identification of neural stem cells (NSCs) from embryonic rat in vitro， and explore the basic biological features of these cells. Methods： The mesencephalon of rat with conceptus age of 13 days was taken out and dissociated into single cell suspension mechanically， and then cultured in serumfree medium. Fetal bovine serum was used to induce cell differentiation. The isolated cells and their progeny were observed by using immunofluorescence technique. Result： The isolated cells showed nestin positive reaction and could be cultured in vitro in series. After being induced by fetal bovine serum， microtubuleassociated protein 2 (MAP2) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) which are specific antigens in neuron and astrocyte expressed in these cells， and synatophymin， a specific signal of synapse， was also expressed in the differentiated neurons. Conclusion： The isolated and cultured cells are NSCs of central nervous system， and possess strong capability of proliferation and potency of multidirectional differentiation.

［Key words］ stem cells; cerebral cortex; cell culture; cell differentiation; embryo; rats， spraguedawley

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，哺乳動物的神經(jīng)組織只有死亡，沒有再生能力。自從上世紀(jì)90年代初科學(xué)家們分離、培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs）以來，人們相繼從各種動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離、培養(yǎng)了NSCs[1，2] 。NSCs的發(fā)現(xiàn)不僅打破了神經(jīng)元不會再生的傳統(tǒng)觀念，而且為許多以往難以治療的神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的治療思路和途徑。2007年6月利用細(xì)胞分離、無血清培養(yǎng)、血清誘導(dǎo)分化及免疫熒光等技術(shù)，證明了本實驗所分離的細(xì)胞群為NSCs，以期為進(jìn)一步使用和研究NSCs奠定理論及實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F12、B27、胎牛血清購自GIBCO公司，bFGF、Nestin抗體、突觸素抗體Snaptophysin購自SIGMA公司，MAP2抗體、GFAP抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡為NIKON公司產(chǎn)品。

1.2 NSCs的分離培養(yǎng)[3～5]

成年雌性和雄性SD大鼠各1只，體重220～260 g，雌雄合籠后，檢查陰栓，見陰栓計為孕0 d；孕14 d時取胎鼠，在解剖顯微鏡下仔細(xì)分離獲得胎鼠大腦皮層，再用DHanks液漂洗，用眼科剪反復(fù)切割組織，再用200目細(xì)胞篩過濾，收集入離心管中，反復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)后，分裝入50 ml培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞數(shù)約為1×106/ml。培養(yǎng)條件: DMEM/F12 6 ml+B27120 μl + bFGF12 μ1，37 ℃， 5%CO2; 每6～7 d傳代1次。

1.3 NSCs的誘導(dǎo)分化

取第4代傳代培養(yǎng)的NSCs，將其吹打成單細(xì)胞后，以5×104/片細(xì)胞密度種于經(jīng)0.1%多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，培養(yǎng)條件為: DMEM/F121.5 ml + B2730 μl + FBS 150 μl， 37 ℃，5%CO2，培養(yǎng)7 d。

1.4 免疫熒光單標(biāo)法鑒定NSCs及其子代細(xì)胞

1.4.1 Nestin免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞

將懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)用4 %多聚甲醛固定30 min后涂在載玻片上，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入一抗Nestin（1∶100）后4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入二抗兔抗羊TRITC(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.4.2 MAP2 、GFAP、Snaptophymin免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞

取誘導(dǎo)分化的NSCs的細(xì)胞蓋玻片用4%多聚甲醛固定30 min，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分別加入一抗MAP2（1∶100）、GFAP（1∶100）和Snaptophysin（1∶100）后4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分別加入二抗羊抗兔FITC(1∶100)和羊抗兔Cy3(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 NSCs的形態(tài)學(xué)特征及鑒定

由孕14 d胎鼠大腦皮層分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞， 接種后立即在相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈懸浮的圓形狀，邊界清楚，折光性強，絕大部分單個存在。經(jīng)6～7 d無血清加bFGF培養(yǎng)后，細(xì)胞呈球狀集落， 95 %以上的NSCs球呈懸浮生長，細(xì)胞增殖旺盛（圖1）。原代培養(yǎng)時，培養(yǎng)瓶中可見一些細(xì)胞碎片和一些貼壁的雜細(xì)胞，但經(jīng)傳代后，這些雜質(zhì)均減少甚至消失，且生長狀態(tài)良好。在相差顯微鏡下，NSCs呈球形或橢圓形，大小不一。經(jīng)Nestin免疫熒光染色鑒定顯示神經(jīng)干細(xì)胞球呈紅色熒光（圖2）。

2.2 NSCs的誘導(dǎo)分化及其鑒定

胎鼠大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、分化及鑒定在NSCs培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清3 h后，NSCs球即開始貼壁和分化，6 h后即可明顯發(fā)現(xiàn)有突起從團(tuán)塊邊緣長出，24 h后有少數(shù)細(xì)胞分化為有突起的細(xì)胞，以后分化的細(xì)胞逐漸增多，從細(xì)胞球周圍遷移出，呈放射狀排列（圖3）；隨著時間的推移，突起不斷增粗與延長并互相連接成網(wǎng)狀，7 d時在相差顯微鏡下NSCs球周圍可見分化成胞體圓形豐滿的神經(jīng)元樣細(xì)胞和突起粗大的膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。免疫熒光染色顯示，在胎牛血清的誘導(dǎo)分化下NSCs能分化成表達(dá)各種相應(yīng)特異性標(biāo)志的終末細(xì)胞，即表達(dá)MAP2的神經(jīng)元（圖4）、表達(dá)GFAP的星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖5）；同時，從NSCs分化而來的神經(jīng)元能表達(dá)突觸素（圖6）。

3 討論

NSCs是指在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的一群細(xì)胞，由于具有廣闊的應(yīng)用前景而受到神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域眾多研究者的關(guān)注，在治療惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾?。ㄅ两鹕?、亨廷頓?。┑确矫嬉讶〉秘S碩的成果[6～8]。

NSCs在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布非常廣泛，本實驗從大腦皮層取材，采用機(jī)械分離法來制備NSCs懸液，實驗效果比較理想。NSCs懸液的制備有酶消化法和機(jī)械分離法，但以酶消化法使用居多。由于在實際操作中很難從客觀上準(zhǔn)確地把握酶作用的最佳時間點，往往導(dǎo)致消化不足而不易獲得單細(xì)胞懸液；或消化過度造成細(xì)胞受損而導(dǎo)致細(xì)胞活力下降甚至死亡。并且，在NSCs表面具有針對許多神經(jīng)生長因子的受體[9]，當(dāng)采用酶消化法來獲取NSCs時， 可能會引起細(xì)胞表面受損而致使一部分受體丟失，而這些受體對于NSCs 維持其干細(xì)胞的未分化狀態(tài)是必需的。所以采用顯微解剖和吸管吹打等機(jī)械分離方法來制備NSCs懸液是神經(jīng)干細(xì)胞分離中較為理想的方法。

本實驗發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)時，培養(yǎng)瓶中可見大量的細(xì)胞碎片和一些貼壁的細(xì)胞，但經(jīng)傳代3～5代后，這些雜質(zhì)逐漸減少甚至消失。這主要是由于培養(yǎng)液中所含的bFGF只對NSCs具有促進(jìn)分裂和增殖作用[10，11]，而其他雜細(xì)胞在該培養(yǎng)液中無法生長。因此，原代細(xì)胞中大部分非NSCs會發(fā)生死亡，而NSCs不僅可以存活，還可以分裂和增殖，形成神經(jīng)干細(xì)胞球，從而經(jīng)過多次傳代后， NSCs可以得到純化。

Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞的一個標(biāo)志物，本實驗培養(yǎng)的細(xì)胞通過免疫熒光觀察培養(yǎng)的細(xì)胞球均呈Nestin免疫反應(yīng)陽性，提示組成細(xì)胞球的細(xì)胞為NSCs。當(dāng)在培養(yǎng)液中加入10％的胎牛血清后，NSCs可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。免疫熒光顯示，誘導(dǎo)分化7 d后NSCs可以分化為表達(dá)MAP2的神經(jīng)元和表達(dá)GFAP的星形膠質(zhì)細(xì)胞，證明了NSCs具有多向分化潛能。同時，本研究觀察到從NSCs誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)元突起上有分化較好的串珠樣排列的膨體，突觸素免疫熒光染色陽性，顯示其已經(jīng)具備接受信息的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，表明分化的神經(jīng)元能夠合成和運輸神經(jīng)遞質(zhì)，行使可能的生理功能[12]。

實驗從孕14 d胎鼠大腦皮層分離培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)具備NSCs的三大特征：Nestin免疫反應(yīng)陽性、分裂增殖能力和多向分化潛能，由此證明了所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是NSCs。并且，由血清誘導(dǎo)分化而來的神經(jīng)元具備一定的生理功能，可以用于進(jìn)一步的實驗研究。

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第7篇

【摘要】

目的 建立Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）分離、培養(yǎng)的方法，并進(jìn)行鑒定、標(biāo)記。方法 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠的MSCs。采用相差顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)學(xué)特征；流式細(xì)胞儀檢測第3代細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表達(dá)率；電鏡檢查第3代MSCs超微結(jié)構(gòu)。DAPI標(biāo)記MSCs為下一步進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞移植示蹤。結(jié)果 原代培養(yǎng)的MSCs于6～8 h后貼壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可達(dá)到80%～90%融合。第3代細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29，CD44，CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微結(jié)構(gòu)清晰，可見細(xì)胞器，如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則，可見較多微絨毛。DAPI可良好標(biāo)記MSCs細(xì)胞核，呈藍(lán)色熒光。結(jié)論 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法能夠成功分離和培養(yǎng)大鼠的MSCs，在第3代可獲得高純度MSCs。DAPI可以作為一種示蹤劑標(biāo)記MSCs。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞培養(yǎng)；間充質(zhì)干細(xì)胞；種子細(xì)胞；示蹤劑

【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. 　About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.

【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，可以向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心肌細(xì)胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于體外擴(kuò)增，因其來源充足、取材方便，體外增殖能力相對較強，而且在異體移植中排斥反應(yīng)小，被認(rèn)為是組織工程和基因工程的理想種子細(xì)胞，為心血管疾病、神經(jīng)疾病和骨關(guān)節(jié)疾病的治療提供了一條全新的治療方案。本文在總結(jié)貼壁分離法培養(yǎng)MSCs的基礎(chǔ)上，優(yōu)化MSCs純化、鑒定、標(biāo)記的方法，以獲得穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，為應(yīng)用組織工程技術(shù)提供大量的種子細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級雄性Wistar大鼠(3周鼠齡，60～70 g)，吉林大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑和藥品

低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，特級胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亞美尼亞倉鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45過氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）儲存液(Sigma 公司)。

1.3 分離和培養(yǎng)

Wistar大鼠麻醉后處死，浸泡酒精15 min，無菌條件下分離股骨、脛骨，無血清DMEM沖洗骨髓腔，取混懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混懸，將獲得的細(xì)胞接種在100 ml培養(yǎng)瓶中，5% CO2，37℃下培養(yǎng)24～48 h，換液，去除未貼壁細(xì)胞，2～3 d更換一次培養(yǎng)基，光鏡觀察細(xì)胞融合情況，細(xì)胞80%融合后傳代，0.25%胰酶消化，用血球計數(shù)儀計數(shù)細(xì)胞、傳代，培養(yǎng)3～5代細(xì)胞。

1.4 透射電鏡樣品制備

將培養(yǎng)3代10 cm2培養(yǎng)皿中約2×106個細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送電鏡室，脫水包埋并制作超薄切片，行透射電鏡觀察并拍照。

1.5 MSCs表面標(biāo)記物檢測

0.25%胰酶消化收獲第3代細(xì)胞，收集1×106個細(xì)胞，洗滌1次，0～4℃預(yù)冷的70%乙醇1 ml邊加入邊搖勻，混勻后置于4℃冰箱待進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測。檢測時以1 ml PBS洗滌2次，加含10%山羊血清的 PBS常溫孵育10 min，1 000 r/min離心5 min去上清，與飽和濃度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC單克隆抗體及其同型對照混勻，室溫下閉光反應(yīng)30 min，PBS 洗滌細(xì)胞，置于冰上，行流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 MSCs標(biāo)記

將無菌的DAPI 儲存液加入培養(yǎng)的MSCs爬片上清中，至終濃度為50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。細(xì)胞至少用Hanks 平衡鹽溶液沖洗6 遍以除去未結(jié)合的DAPI。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞爬片。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，約6～8 h可見MSCs細(xì)胞貼壁，呈圓形或多角形，換液后，貼壁細(xì)胞清晰可見，2～3 d后可見少量短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長，伸出偽足呈逗點狀或短棒狀；6 d左右可見放射狀排列的細(xì)胞集落，伸出長短不一、粗細(xì)不均的突起、胞核大、核仁清晰。約14 d細(xì)胞融合80%～90%，呈漩渦狀。傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞貼壁快，24 h內(nèi)已全部貼壁、伸展，增殖迅速，均勻分布生長，3～4 d可見長梭形細(xì)胞80%～90%鋪滿培養(yǎng)皿形成單層。見圖1。

2.3 MSCs的鑒定及標(biāo)記

第3代細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD44、CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。見圖3。細(xì)胞經(jīng)DAPI標(biāo)記后，細(xì)胞核呈藍(lán)色。見圖4。

3 討 論

由于骨髓的細(xì)胞組成復(fù)雜，細(xì)胞功能各異，其中MSCs含量很低，約為骨髓低密度組分中有核細(xì)胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分離高純度的MSCs是原代培養(yǎng)關(guān)鍵性技術(shù)。目前，獲得MSCs的方法主要有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法、免疫磁珠分選法〔4〕。而骨髓貼壁法操作步驟簡單，既降低了離心對細(xì)胞的損害，又減少了污染機(jī)會，且分離的MSCs貼壁時間短，增殖快，細(xì)胞數(shù)量多，經(jīng)傳代后能夠純化，提示全骨髓貼壁法是一種更加簡單有效的MSCs分離方法。

一般認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞沒有特異性表面抗原，整合素家族成員CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要標(biāo)志物〔5〕，而MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原，如造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34、成熟造血細(xì)胞標(biāo)志抗原CD38、白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45、淋巴細(xì)胞表面抗原CD11a和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面抗原CD14。因此，實驗選取MSCs表達(dá)陽性的指標(biāo)CD29、CD44，以及表達(dá)陰性的指標(biāo)CD34和CD45作為鑒定參考指標(biāo)〔2，6〕。本研究選擇了CD29、CD34、CD44和CD45進(jìn)行檢測，結(jié)果表明培養(yǎng)的細(xì)胞CD29和CD44陽性，CD34和CD45陰性，符合MSCs的特點，經(jīng)過傳代，第三代可獲得較高純度的MSCs，可以作為穩(wěn)定的種子細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)研究。

DAPI是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測。DAPI對活細(xì)胞無毒性，不改變細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)，熒光保持時間較長。移植細(xì)胞的標(biāo)記是研究其在體內(nèi)的定位不可缺少的，目前常用的標(biāo)記法有DAPI標(biāo)記法、溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標(biāo)記法、染色體標(biāo)記法、基因標(biāo)記法。BrdU法存在只能標(biāo)記增殖期細(xì)胞，且標(biāo)記細(xì)胞不能直接觀察等不足。染色體標(biāo)記主要將雄性供體動物細(xì)胞移植到雌性動物體內(nèi)，通過Y染色體雜交區(qū)別確認(rèn)移植細(xì)胞。其優(yōu)點在于可以終生標(biāo)記，但也存在操作繁瑣，無法觀察活細(xì)胞等不足?；驑?biāo)記法通過基因轉(zhuǎn)染或直接從轉(zhuǎn)基因動物取材，使被標(biāo)記細(xì)胞攜帶綠色熒光蛋白（GFP）暼報告基因。但目前，實現(xiàn)報告基因在目的細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá)仍然存在程序繁瑣、實驗周期長、成功率低等困難，而從轉(zhuǎn)基因動物取材又因為動物來源困難，在國內(nèi)較少開展〔7〕。本研究表明，DAPI起初標(biāo)記率很高(接近100%)，1 w內(nèi)可維持80%～90%標(biāo)記率。但隨著標(biāo)記時間的延長，其標(biāo)記效率迅速下降，3 w以后絕大多數(shù)細(xì)胞失去標(biāo)記。

本實驗完善貼壁法建立Wistar大鼠MSCs培養(yǎng)體系，經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高，可以為體內(nèi)移植提供大量的種子細(xì)胞。采用DAPI 進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記后，熒光顯微鏡下見所有MSCs 均已被標(biāo)記藍(lán)色熒光，提示DAPI 標(biāo)記法敏感性好，標(biāo)記效率高，可應(yīng)用進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞移植的良好標(biāo)記。

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