時(shí)間：2023-03-06 16:05:38
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建軍節(jié)的習(xí)俗一：擁軍活動(dòng)八一建軍節(jié)的習(xí)俗主要是個(gè)機(jī)關(guān)部門和社會(huì)團(tuán)體開展形式各樣的擁軍活動(dòng)。
每年建軍節(jié)，部隊(duì)都組織盛大的紀(jì)念活動(dòng)，慶祝自己的節(jié)日。各級(jí)政府，也組織隆重的軍民聯(lián)歡晚會(huì)或座誡會(huì)，邀請(qǐng)老、軍隊(duì)離退休干部復(fù)員退伍軍人、革命傷殘軍人及烈軍屬代表參加。同時(shí)，還要組織擁軍優(yōu)屬活動(dòng)，宣傳人民軍隊(duì)的光榮傳統(tǒng)，檢查優(yōu)撫工作的落實(shí)情況。發(fā)現(xiàn)問題和困難及時(shí)給予解決。
建軍節(jié)的習(xí)俗二：墓祭奠英雄人物在這一天，全軍將會(huì)舉辦各種活動(dòng)來慶祝他們自己的活動(dòng)。有的在部隊(duì)舉辦文藝演出，展示他們的才能;有的則到社區(qū)訪問孤寡老人，為他們獻(xiàn)上一份親情般的溫暖;而有的則會(huì)到革命烈士陵園掃墓或者進(jìn)行網(wǎng)上祭奠，以此來紀(jì)念那些為革命、為人民獻(xiàn)出寶貴生命的英雄人物。
進(jìn)行網(wǎng)上祭奠，以此來紀(jì)念那些為革命、為人民獻(xiàn)出寶貴生命的英雄人物。
在八一建軍節(jié)這天的掃墓活動(dòng)中，不像清明節(jié)時(shí)的嚴(yán)肅和莊重，他們一般會(huì)在碑墓前舉行一些紀(jì)念活動(dòng)，與其說是表示對(duì)革命先輩悶得的崇敬與懷念，倒不如說是為了紀(jì)念他們的功績(jī)和對(duì)當(dāng)下幸福生活的珍惜。祭奠時(shí)的程序和清明節(jié)掃墓差不多，一般會(huì)有打掃、供奉水果佳肴，或植樹、獻(xiàn)花圈、致禱詞等，隨后有的軍人部隊(duì)還會(huì)去拜訪先烈們的家屬，從活著的人那里聆聽教誨。與進(jìn)行實(shí)地紀(jì)念不同的時(shí)，在科技發(fā)達(dá)的現(xiàn)今社會(huì)，他們還可以通過互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行網(wǎng)上祭奠，這也是未來掃墓祭奠活動(dòng)的必然趨勢(shì)。
建軍節(jié)的習(xí)俗三：看望慰問老同志走訪慰問軍隊(duì)離退休老同志老干部，向他們致以節(jié)日的問候和良好的祝愿。
為他們送上節(jié)日的問候，對(duì)軍隊(duì)老同志們?cè)诟锩鼞?zhàn)爭(zhēng)年代所作出的貢獻(xiàn)以及長(zhǎng)期以來對(duì)地方經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的關(guān)心支持表示感謝，祝愿他們健康長(zhǎng)壽、晚年幸福、合家歡樂。
關(guān)鍵詞：秸稈；纖維素降解細(xì)菌；篩選；酶活性；產(chǎn)酶條件
中圖分類號(hào)：Q939.96；X712 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）05-1121-04
Screening of Cellulose-Degrading Bacteria and Optimization of Enzyme-Production Conditions
WANG Shuang，XU Jie，LI Xi-yuan，XIANG Ying，PAN Yang-nan，XIA Tian
（Taizhou Institute of Science and Technology， Nanjing University of Science and Technology，Taizhou 225300， Jiangsu， China）
【摘要】 細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)在質(zhì)量監(jiān)測(cè)中具有重要的意義，目前除了經(jīng)典的平板培養(yǎng)法以外，還有微菌落法、阻抗法等快速檢測(cè)方法，這些方法或者需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間，或者需要較高的檢測(cè)成本。本研究提出一種不需要培養(yǎng)而在濾膜上直接計(jì)數(shù)的細(xì)菌總數(shù)的快速檢測(cè)方法，它主要分為過濾、染色、顯微鏡計(jì)數(shù)和計(jì)算四個(gè)步驟。計(jì)算細(xì)菌總數(shù)時(shí)，根據(jù)細(xì)菌在濾膜上的分布特點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)公式進(jìn)行改進(jìn)，提出按區(qū)域計(jì)算細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算方法，提高了檢測(cè)精度。研究結(jié)果表明，該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無顯著性差異（t=0.847，P=0.436＞0.05），是一種低成本、快速的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法。
【關(guān)鍵詞】 細(xì)菌總數(shù)；檢測(cè)；直接計(jì)數(shù)；濾膜；染色
Abstract：Rapid detection of total bacteria number is very important in quality control. Now， there are many rapid detection methods of total bacteria number， such as microclony method， bioelectrical impedance method and so on， besides the plate counting method. But these methods need more time or higher cost. So we presented a new method， observing directly on the filter without germculture， it included four steps， filtration， coloration， observation and calculation. Based on the point of distributing， a new formula was put forward other than former formula， so it improved the detection precision. The results reveal that there are no significant differences between the new method and the plate counting method (t=0.847， P=0.436＞0.05 )， and it is a lower cost and faster detection method of total bacteria number.
Key words：Total bacteria number; Detection; Observing directly;Filter;Coloration
1 引 言
細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)的研究已有很多，目前國(guó)標(biāo)規(guī)定的方法為平板計(jì)數(shù)法，該方法是將樣品加入瓊脂營(yíng)養(yǎng)基，在37 ℃下培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。這種方法精度高，但耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿足實(shí)際工作需要。為了簡(jiǎn)化檢測(cè)程序、縮短檢測(cè)時(shí)間，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的快速檢測(cè)方法的研究，提出了阻抗檢測(cè)法［1］、Simplate TM全平器計(jì)數(shù)法［2］、微菌落技術(shù)［3-5］、紙片法［6-7］等檢測(cè)方法，取得了一定的成果，但檢測(cè)時(shí)間仍在4 h以上。
本研究在分析了已有研究成果的基礎(chǔ)上，提出了在濾膜上染色后，直接計(jì)數(shù)的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法，具體步驟為：用集菌儀進(jìn)行細(xì)菌收集在膜上進(jìn)行染色在油鏡下計(jì)數(shù)按公式計(jì)算出菌液濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無顯著性差異，檢測(cè)時(shí)間約1 h，是一種快速的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法。
2 材料與方法
2.1 材料
本研究中用的試驗(yàn)材料有集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），染色劑，生物顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司），聚碳酸脂膜（直徑47 mm）。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 準(zhǔn)備工作 卸下集菌儀的濾網(wǎng)（見圖1），統(tǒng)計(jì)濾網(wǎng)上小孔總數(shù)，為計(jì)算菌液濃度做準(zhǔn)備。另外，還需對(duì)集菌儀中的集菌器進(jìn)行高壓滅菌，以防止過濾過程中引入外源細(xì)菌。
2.2.2 細(xì)菌收集 取一定濃度的霉菌菌液300～500 ml，裝在集菌儀上，集菌儀采用蠕動(dòng)加壓方式對(duì)菌液施加一定的壓力，使菌液流過孔徑為0.45 um的聚碳酸脂膜。采用過濾方法是因?yàn)樗梢允辜?xì)菌相對(duì)均勻地分布在濾膜上，而選用聚碳酸脂膜是因?yàn)檫@種膜具有良好的透光性，便于用顯微鏡觀察。
2.2.3 染色 集菌后取下濾膜，切下一部分放在載玻片上，進(jìn)行染色、固定。染色的目的是增大細(xì)菌與背景的對(duì)比度，便于觀察。
2.2.4 顯微鏡計(jì)數(shù)與計(jì)算 菌液經(jīng)集菌儀過濾后，細(xì)菌在濾膜上的分布見圖2、圖3，由圖可以看出細(xì)菌分布具有以下兩個(gè)特點(diǎn)：一是細(xì)菌集中在一個(gè)個(gè)的圓形區(qū)域內(nèi)，這些圓形區(qū)域和擋板的小孔相對(duì)應(yīng)；二是各個(gè)圓形區(qū)域之間細(xì)菌很少。根據(jù)膜上細(xì)菌分布的這種特點(diǎn)，提出以圓形區(qū)域?yàn)閱挝贿M(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)出圓形區(qū)域內(nèi)細(xì)菌的平均個(gè)數(shù)，從而計(jì)算出菌液中細(xì)菌總數(shù)。具體步驟如下：隨機(jī)選擇10個(gè)圓形區(qū)域，在油鏡下，調(diào)節(jié)焦距以獲得較清晰的圖像（見圖4），統(tǒng)計(jì)每個(gè)圓形區(qū)域內(nèi)的細(xì)菌個(gè)數(shù)，然后按公式(1)計(jì)算出菌液的濃度。
X=A10×N/V(1)圖2 膜上細(xì)菌的區(qū)域分布
Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍)
圖3 膜上細(xì)菌的區(qū)域間隔
Fig 3 The space among the distributing regions(100倍)
圖4 膜上細(xì)菌染色后圖像
Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000倍)
式中：X表示待檢菌液濃度（CFU/ml）
A表示10個(gè)圓形區(qū)域內(nèi)細(xì)菌總數(shù)
N表示濾網(wǎng)上小孔總數(shù)
V表示集菌時(shí)所用待檢菌液體積（ml）
3 結(jié)果與討論
3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
按上述方法計(jì)算得到的結(jié)果與平板培養(yǎng)法得到的結(jié)果見表1。表1 兩種方法得到的細(xì)菌總數(shù)
Table 1 Total bacteria number by two different methods
樣本1樣本2樣本3樣本4樣本5樣本6染色鏡檢
(cfu/ml）185168157165171166平板培養(yǎng)
(cfu/ml)176155165158183152
對(duì)表1中兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，在α=0.05時(shí)，雙尾檢驗(yàn)結(jié)果如下：t=0.847，P=0.436＞0.05，說明兩種方法得到的結(jié)果無顯著性差異。
3.2 討論
3.2.1 計(jì)算公式的改進(jìn) 用集菌儀對(duì)樣本菌液進(jìn)行過濾時(shí)，由于濾網(wǎng)擋板的作用，使得細(xì)菌不是均勻地分布在整個(gè)濾膜上，而是集中分布在濾網(wǎng)的小孔處，所以，計(jì)算細(xì)菌總數(shù)時(shí)，不能采用公式X=A40×Φ1Φ22/V（其中Φ1，Φ2分別為濾膜直徑和視野直徑），該公式是微菌落方法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)中的常用計(jì)算公式。在本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)細(xì)菌分布的特點(diǎn)，提出以圓形區(qū)域?yàn)閱挝挥?jì)算細(xì)菌總數(shù)的思路，使計(jì)算結(jié)果更接近真實(shí)值，從而提高了檢測(cè)精度。
3.2.2 細(xì)菌大小的影響 細(xì)菌大小對(duì)本實(shí)驗(yàn)的影響主要體現(xiàn)在鏡檢時(shí)，如果細(xì)菌太小，顯微鏡計(jì)數(shù)時(shí)不能將細(xì)菌從背景中分辨出來，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不能分辨大腸桿菌和葡萄球菌，而較大的霉菌可以清晰地分辨。
3.2.3 檢測(cè)時(shí)間進(jìn)一步縮短 細(xì)菌總數(shù)的經(jīng)典檢測(cè)方法是平板培養(yǎng)法，得到的結(jié)果精度高，但是它所用時(shí)間長(zhǎng)，為了縮短檢測(cè)時(shí)間，出現(xiàn)了微菌落法，將檢測(cè)時(shí)間縮短為4 h左右［3-5］。本研究不對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，而是在膜上染色后直接用顯微鏡計(jì)數(shù)，最大限度地縮短了檢測(cè)時(shí)間，使整個(gè)檢測(cè)時(shí)間在1 h左右。
4 結(jié)論
本研究用集菌儀將菌液過濾后，取濾膜一部分進(jìn)行染色、制片，然后在油鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)菌個(gè)數(shù)。根據(jù)細(xì)菌在濾膜上的分布特點(diǎn)，提出將圓形區(qū)域作為統(tǒng)計(jì)單位，得到圓形區(qū)域內(nèi)細(xì)菌的平均個(gè)數(shù)，從而計(jì)算出菌液濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，按照該方法得到的結(jié)果與平板培養(yǎng)法的結(jié)果無顯著性差異。與平板培養(yǎng)法和微菌落法相比，該方法不需要細(xì)菌培養(yǎng)，檢測(cè)時(shí)間只需要1 h左右，明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間，是一種快速、有效的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法。
參考文獻(xiàn)
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關(guān)鍵詞：溫泉；嗜熱細(xì)菌；熱穩(wěn)定纖維素酶；分離；鑒定
中圖分類號(hào)：q939.9；q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a 文章編號(hào)：0439-8114（2014）07-1516-04
isolation and identification of thermophiles degrading cellulose in hot spring
mei fan1a，1b，lin bai-xue1a，zhao chao1a，1b，liu bin1a，1b，2
（1a.college of food science；1b.institute of bioenergy， fujian agriculture and forestry university， fuzhou 350002， china；
2.china national engineering research center of juncao technology， fuzhou 350002， china）
abstract： culture-based approach was used to isolate thermophiles from hot spring. in total， 27 thermophilic bacterial strains were isolated from hot springs in nevada of usa and yongtai hot spring in fujian province of china. superior cellulose and hemicellulose decomposing strains were screened and identified by 16s rdna. the results showed that ly7 and ly8 degrading cellulose were indentified as alicyclobacillus sp. ly7 and geobacillus sp. ly8. geobacillus sp. ly8 could be cultured at temperature ranging from 40 ℃ to 70 ℃， with the optimal temperature of 65 ℃. the β-glucosidase activity of ly8 was 145 iu/ml.
key words： hot spring； thermophiles； thermostable cellulase； separation； identification
纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱。根據(jù)酶的功能差異分為三類：①內(nèi)切葡聚糖酶（ec 3.2.1.4）；②外切葡聚糖酶（ec 3.2.1.91）；③β-葡萄糖苷酶（ec 3.2.1.21）[1，2]。纖維素酶降解纖維素是酶系各組分之間協(xié)同作用的結(jié)果。首先由內(nèi)切葡聚糖酶在纖維素分子內(nèi)部非結(jié)晶區(qū)進(jìn)行隨機(jī)的酶切產(chǎn)生小分子的纖維素，然后由外切葡聚糖酶以纖維二糖為單位從纖維素線性末端進(jìn)行水解，每次切下一個(gè)纖維二糖分子，最后由β-葡萄糖苷酶將纖維二糖以及短鏈纖維寡糖水解成葡萄糖[3-5]。
嗜熱菌是一類能在45 ℃以上生長(zhǎng)和繁殖的極端環(huán)境微生物，包括部分細(xì)菌、古菌和真菌三大類，通常分布在地?zé)岘h(huán)境和人工高溫環(huán)境中，如溫泉、地?zé)釁^(qū)土壤、深?；鹕娇凇⑸詈嵋簠^(qū)以及高溫堆肥、熱水器等環(huán)境[6]。嗜熱菌產(chǎn)生的熱穩(wěn)定酶具有耐熱性、高效性以及對(duì)有機(jī)溶劑、去污劑和變性劑的較強(qiáng)抗性，在食品、醫(yī)藥、生物質(zhì)能源、生物工程及廢物處理等方面都得到廣泛的應(yīng)用[7]。其中，熱穩(wěn)定的纖維素酶在纖維素的轉(zhuǎn)化中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。研究表明，許多高溫菌具有分解纖維素的能力，如芽孢桿菌屬（bacillus）、梭狀芽孢桿菌屬（clostridium）、脫硫腸狀菌屬（desulfotomaculum）、熱酸桿菌屬的解纖維素?zé)崴釛U菌（acidothermus cellulolyticus）、喜熱菌屬（caloramator）的厭氧和分解纖維素高溫菌na10菌株[8]。由于高溫有利于纖維素的降解，而高活力熱穩(wěn)定的纖維素酶更是纖維素酶研究的重要內(nèi)容。因此，研究采用純培養(yǎng)的方法從溫泉樣品中篩選出能降解纖維素的耐熱性菌株并進(jìn)行了16s rdna鑒定，為在常溫條件下獲得有價(jià)值的熱穩(wěn)定性強(qiáng)的酶奠定了基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
溫泉樣品：大盆地溫泉和大沸泉，溫度42.5～97.0 ℃，取自美國(guó)內(nèi)達(dá)華州；42～70 ℃溫泉樣品，取自福建福州永泰。菌株escherichia coli dh5α為福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 嗜熱細(xì)菌的分離 將泥樣和水樣混合均勻后，以500 r/min離心2 min，去除大顆粒的雜質(zhì)，然后以10 000 r/min離心10 min，獲得菌體沉淀。水樣可以直接利用。處理后的樣品分別置于4 ℃冰箱和-70 ℃超低溫冰箱。取處理好的樣品加適量無菌生理鹽水稀釋，取1
00 μl涂布于zobell 2216e或者tim改良后的tm固體培養(yǎng)基上，置于不同溫度的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行劃線分離，反復(fù)分離至單一菌落。 1.2.2 嗜熱菌全菌蛋白分析 將提取純化得到的嗜熱菌全菌蛋白進(jìn)行sds-page凝膠電泳，挑選具有不同電泳帶型的嗜熱菌菌株進(jìn)行復(fù)篩。
1.2.3 降解纖維素嗜熱菌的篩選 將純化得到的嗜熱菌分別點(diǎn)種于纖維素篩選平板上，置于合適的溫度下培養(yǎng)1～2 d。用0.1%剛果紅染色0.5 h，再用1 mol/l nacl溶液脫色0.5 h，挑選有透明圈的菌落，測(cè)量透明圈直徑，進(jìn)行初篩。復(fù)篩采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于120 r/min下培養(yǎng)36 h，測(cè)定發(fā)酵液酶活[9，10]。
1.2.4 16s rdna基因序列的pcr擴(kuò)增和鑒定 用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取嗜熱菌基因組dna，再進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將回收后的16s rdna片段與pmd18-t vector 在16 ℃連接過夜，再轉(zhuǎn)化至e. coli dh5α中。將提取得到的質(zhì)粒經(jīng)hind ⅲ限制性內(nèi)切酶和bamh i限制性內(nèi)切酶在37 ℃反應(yīng)3～4 h，取適量酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，分析插入片段的大小，確定克隆是否成功[11]。
1.2.5 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析 陽(yáng)性克隆的測(cè)序由北京天根生物科技公司完成。核酸序列相似性分析采用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information， ncbi）提供的比對(duì)搜索工具blast（basic local alignment search tool， blast）進(jìn)行搜索（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。用clustal x（1.83）進(jìn)行序列比對(duì)，采用mega構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
2 結(jié)果與分析
2.1 嗜熱菌的分離純化和菌株分型
每個(gè)樣品經(jīng)過處理后，涂布于嗜熱菌分離培養(yǎng)基zobell 2216e或者tim改良后的tm固體培養(yǎng)基上，分別在53 、60 、65 、70 、85 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過多次劃線分離純化得到27株嗜熱菌菌株。
部分嗜熱菌的菌落形態(tài)如表1所示。已純化的嗜熱細(xì)菌菌株采用甘油法保存于-70 ℃冰箱。
采用嗜熱菌全菌蛋白的sds-page凝膠電泳（圖1）對(duì)27株嗜熱菌進(jìn)行初步篩選。挑選具有不同電泳帶型的嗜熱菌菌株進(jìn)行下一步的研究。
2.2 降解纖維素嗜熱菌的篩選與鑒定
2.2.1 產(chǎn)纖維素酶嗜熱菌的篩選 采用剛果紅染色法從永泰溫泉篩選到兩株具有較強(qiáng)纖維素降解能力的菌株ly8和ly7，對(duì)這兩株菌株的形態(tài)進(jìn)行觀察，并進(jìn)行鑒定。
2.2.2 產(chǎn)纖維素酶嗜熱菌的形態(tài)特征 兩株菌株都是桿狀、有芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌，菌落均是白色。ly7沒有鞭毛，ly8有鞭毛（表2）。
2.2.3 降解纖維素嗜熱菌的酶活活性 纖維素酶根據(jù)酶的功能的差異可分為三類：內(nèi)切葡聚糖酶（eg），外切葡聚糖酶（cbh），β-葡萄糖苷酶（bgl）。如圖2所示，ly8內(nèi)切葡聚糖酶活性高達(dá)145 iu/ml。
2.3 降解纖維素嗜熱菌的鑒定
2.3.1 產(chǎn)纖維素酶嗜熱菌的16s rdna鑒定 將ly7和ly8接種液體培養(yǎng)基，65 ℃培養(yǎng)36 h后離心收集菌體，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取這兩株嗜熱菌的基因組dna。用細(xì)菌通用引物euba27f和euba1492r進(jìn)行16s rdna 的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約1 500 bp，結(jié)果見圖3。
將純化回收的16s rdna pcr產(chǎn)物與pmd 18-t 載體連接，轉(zhuǎn)化e. coli dh5α，雙酶切驗(yàn)證后（圖4）送北京天根生物科技公司測(cè)序。
2.3.2 序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析 ly7和ly8的16s rdna測(cè)序結(jié)果表明，菌株ly7的16s rdna為1 531 bp，菌株ly8的16s rdna為1 552 bp。用blast在ncbi中搜索同源序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果（圖5）顯示，菌株ly7屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬（alicyclobacillus），菌株ly8屬于土芽孢桿菌屬（geobacillus），生長(zhǎng)溫度為40～70 ℃，最適溫度65 ℃。
3 小結(jié)與討論
本研究以纖維素為底物，從美國(guó)內(nèi)達(dá)華州溫泉和中國(guó)福建永泰溫泉分離得到兩株產(chǎn)纖維素酶的嗜熱細(xì)菌菌株ly7和ly8，它們的最適反應(yīng)溫度為65 ℃，而目前文獻(xiàn)中報(bào)道的纖維素降解菌株最適溫度為30 ℃左右，因此本研究篩選的菌株可在很多工業(yè)和生物技術(shù)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。嗜熱細(xì)菌ly8的酶活最高，其內(nèi)切葡聚糖酶活性最高達(dá)145 iu/ml，與文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶活性較高的幾株菌株（綠色木霉c-08最高酶活為89 iu/ml[12]、里氏木霉40359最高酶活100 iu/ml[13]）相比，可知嗜熱細(xì)菌ly8內(nèi)切酶活性最高。雖然目前工業(yè)上纖維素酶產(chǎn)生菌trichoderma reesei工程菌mcg80發(fā)酵酶活為300～500 iu/ml[14]，但嗜熱細(xì)菌ly8
為一株野生菌株，酶活能夠達(dá)到這個(gè)水平，說明很有應(yīng)用前景，如果再通過誘變育種很可能成為一個(gè)生產(chǎn)菌株，而且其可在高溫范圍降解纖維素，有著常溫細(xì)菌不可比擬的優(yōu)勢(shì)。通過16s rdna序列鑒定，ly8屬于土芽孢桿菌屬（geobacillus），ly7屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬（alicyclobacillus）。由于真菌降解纖維物質(zhì)主要是通過分泌大量的胞外酶來進(jìn)行的，因此纖維素降解真菌在纖維素酶的開發(fā)和應(yīng)用上具有細(xì)菌、放線菌等所不具有的優(yōu)勢(shì)。然而，本研究的細(xì)菌體內(nèi)存在著獨(dú)特的耐高溫代謝途徑和耐高溫酶，如果通過分子生物學(xué)方法克隆這些耐高溫酶的基因，并使其在畢赤酵母等真菌宿主中進(jìn)行表達(dá)，就可以在常溫條件下獲得有價(jià)值的熱穩(wěn)定性強(qiáng)的酶，因此具有極高的研究和應(yīng)用價(jià)值。
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關(guān)鍵詞 細(xì)菌性食物中毒 檢驗(yàn) 影響因素
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2009.20.168
影響因素
采集樣品缺乏及時(shí)性:由于一些消費(fèi)者對(duì)《食品衛(wèi)生法》觀念淡薄,缺乏自我保護(hù)意識(shí),發(fā)生食物中毒后,不能首先及時(shí)向衛(wèi)生監(jiān)督部門報(bào)告疫情,而是自己與經(jīng)營(yíng)者私自交涉,在不能如愿的情況下才向衛(wèi)生監(jiān)督部門舉報(bào),因此造成一些經(jīng)營(yíng)者在知道發(fā)生食物中毒的情況下,首先處理掉一切可能的剩余食品,對(duì)加工經(jīng)營(yíng)現(xiàn)場(chǎng)、工具、容器進(jìn)行了消毒和處理,延誤了有效的報(bào)告時(shí)間,從而影響了對(duì)可疑食物的采集[1]。
采集樣品缺乏代表性:由于食物中毒是突發(fā)公共衛(wèi)生事件,細(xì)菌性食物中毒都有特定的潛伏期,毒素性中毒一般有1～3小時(shí),細(xì)菌性中毒一般6～10小時(shí)。當(dāng)衛(wèi)生監(jiān)督部門接到疫情報(bào)告趕赴現(xiàn)場(chǎng)時(shí),往往時(shí)間周期較長(zhǎng),可疑食物已被清理,即使采到幾份剩余食品,也可能不是食物中毒當(dāng)天餐桌上的剩余食物,因此常出現(xiàn)食品中檢出的細(xì)菌與病人排泄物中檢出的細(xì)菌不相符,影響了中毒結(jié)果的分析。另外,食品加工、制作現(xiàn)場(chǎng)能提供線索的環(huán)節(jié)已被經(jīng)營(yíng)者清掃、消毒,食具和用具已被清洗干凈,同樣也影響了食品加工工具、容器、場(chǎng)所的采樣和檢驗(yàn)。
采集樣品缺乏典型性:中毒病人發(fā)病后,患者一般自行服用抗菌類藥物,嚴(yán)重時(shí)才到醫(yī)院就醫(yī)。由于一些醫(yī)務(wù)人員對(duì)食物中毒報(bào)告制度不夠了解,導(dǎo)致了只管用藥治療,忽視了對(duì)病人嘔吐物、排泄物的留取,導(dǎo)致了大量的抗生素抑制了致病菌的繁殖,從而影響了致病菌的檢出率。
采集樣品缺乏完整性:一般中毒病人發(fā)病期的血樣容易采到,而采集病人恢復(fù)期的血樣,由于病人的不配合或提前出院往往采集不到,也影響了檢驗(yàn)結(jié)果的全面分析。
采集樣品缺乏真實(shí)性:食物中毒的采樣應(yīng)該實(shí)事求是,如果剩余食品已不存在,食品加工環(huán)境現(xiàn)場(chǎng)已被破壞,則應(yīng)把檢測(cè)重點(diǎn)放在中毒患者的樣品方面,而有些食品經(jīng)營(yíng)者自行送一些與食物中毒無關(guān)的樣品,故意掩飾自己的過失。
對(duì) 策
加強(qiáng)行政管理措施:大力普及《食品衛(wèi)生法》,加強(qiáng)對(duì)食品生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)者和從業(yè)人員的衛(wèi)生法制教育,嚴(yán)格食品衛(wèi)生管理和消毒制度。炎熱高溫季節(jié)在規(guī)模較大的酒宴上,對(duì)供應(yīng)熟、鹵制品,冷葷涼拌菜等高危食品,應(yīng)建立24小時(shí)留樣制度,以備食物中毒危險(xiǎn)因素的檢驗(yàn)鑒定和檢測(cè)監(jiān)督。對(duì)不具備熟食、鹵菜加工和衛(wèi)生設(shè)施者應(yīng)依法給予取締,保障消費(fèi)者的身體健康。加強(qiáng)《食品衛(wèi)生法》宣傳力度,普及食品衛(wèi)生相關(guān)知識(shí),使全民懂得用法律保護(hù)自己,在食物中毒發(fā)生后應(yīng)及時(shí)向衛(wèi)生監(jiān)督部門舉報(bào),使衛(wèi)生監(jiān)督部門能在最早的時(shí)間里對(duì)事故進(jìn)行調(diào)查和取樣,以獲得最佳的檢驗(yàn)結(jié)果。衛(wèi)生監(jiān)督部門要加強(qiáng)與衛(wèi)生醫(yī)療單位的聯(lián)系,醫(yī)療機(jī)構(gòu)要組織醫(yī)務(wù)人員學(xué)習(xí)有關(guān)的衛(wèi)生法規(guī),在工作中要認(rèn)真執(zhí)行食物中毒報(bào)告制度,一旦發(fā)生食物中毒有關(guān)的疫情,應(yīng)及時(shí)上報(bào)衛(wèi)生監(jiān)督部門,對(duì)因食物中毒而引起腹瀉的病人進(jìn)行診療前應(yīng)盡量做到先留取樣品再行治療[2]。
保證樣品采集質(zhì)量:①衛(wèi)生檢驗(yàn)人員應(yīng)準(zhǔn)備好細(xì)菌性食物中毒檢驗(yàn)的采樣器材(滅菌采樣容器、運(yùn)送培養(yǎng)基、無菌棉簽、采血針筒、無菌試管等),應(yīng)與現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)督人員共同深入現(xiàn)場(chǎng)、分析食物中毒的原因,及時(shí)全面采集有效樣品(剩余食品、嘔吐物、排泄物、病人血液、廚具、盛裝食品的容器和加工食品工作臺(tái)面的涂擦物、肛拭等),保證檢驗(yàn)樣品的數(shù)量和質(zhì)量。②采集病人發(fā)病期和恢復(fù)期的雙份血樣,檢測(cè)其抗體效價(jià),對(duì)確診食物中毒致病原因可提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)也可排除食品、大便和環(huán)境中檢出的其他病原菌[3]。③采集盛裝食品的容器、冰柜內(nèi)壁及加工食品操作臺(tái)面涂擦物,對(duì)未能采集到剩余食品時(shí)其檢出的致病菌,也可作為食物中毒的間接依據(jù)。如果在廚房貼板、冰箱內(nèi)壁樣品中分離到的致病菌和病人樣品中分離到的致病菌相同,也可作為食物中毒的依據(jù)。
提高致病菌的檢出率:①對(duì)所有樣品進(jìn)行致病菌分離和鑒定時(shí)應(yīng)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法和已公認(rèn)的微生物檢驗(yàn)程序進(jìn)行,應(yīng)用直接分離及增菌雙重培養(yǎng),直接分離可檢出樣品中的優(yōu)勢(shì)菌(包括一些條件致病菌),增菌可將樣品中污染的但與菌量較少的致病菌檢出,同時(shí)對(duì)服藥患者肛拭樣品中被抗生素抑制的細(xì)菌達(dá)到復(fù)蘇和增加菌量的作用。②由于多種病原菌引起的食物中毒,都有類似的臨床癥狀,因此對(duì)致病菌的檢測(cè)范圍應(yīng)該擴(kuò)大,在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)多準(zhǔn)備一些各類細(xì)菌的選擇性培養(yǎng)基,采取多思路、多方法同時(shí)檢測(cè)各種致病菌的原則,從而獲得滿意的、真實(shí)的檢驗(yàn)結(jié)果[4]。
討 論
衛(wèi)生監(jiān)督部門也經(jīng)常會(huì)接到此類突發(fā)公共衛(wèi)生事件疫情報(bào)告和群眾的舉報(bào),通過對(duì)患者的個(gè)案調(diào)查、流行病學(xué)分析、現(xiàn)場(chǎng)衛(wèi)生學(xué)監(jiān)督檢查、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn),查明中毒原因,綜合分析是否為一起細(xì)菌或毒素性食物中毒。由此可見,實(shí)驗(yàn)室能否及時(shí)、準(zhǔn)確、快速地出具檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)查明中毒原因,具有舉足輕重的作用。它可以為食物中毒事件的確定和為現(xiàn)場(chǎng)采取有效行政控制措施提供科學(xué)依據(jù)。而采樣是保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和影響檢出率高低的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
參考文獻(xiàn)
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1.擁軍活動(dòng)
八一建軍節(jié)的習(xí)俗主要是個(gè)機(jī)關(guān)部門和社會(huì)團(tuán)體開展形式各樣的擁軍活動(dòng)。
每年建軍節(jié)，部隊(duì)都組織盛大的紀(jì)念活動(dòng)，慶祝自己的節(jié)日。各級(jí)政府，也組織隆重的軍民聯(lián)歡晚會(huì)或座誡會(huì)，邀請(qǐng)老、軍隊(duì)離退休干部復(fù)員退伍軍人、革命傷殘軍人及烈軍屬代表參加。同時(shí)，還要組織擁軍優(yōu)屬活動(dòng)，宣傳人民軍隊(duì)的光榮傳統(tǒng)，檢查優(yōu)撫工作的落實(shí)情況，發(fā)現(xiàn)問題和困難及時(shí)給予解決。
各級(jí)政府、廣大人民群眾歷來把開展擁軍優(yōu)屬活動(dòng)作為紀(jì)念建軍節(jié)的“保留節(jié)日”。中學(xué)團(tuán)組織可以在建軍節(jié)前后積極組織各種形式的擁軍優(yōu)屬活動(dòng)，通過“軍營(yíng)一日”體驗(yàn)人民軍隊(duì)嚴(yán)明的紀(jì)律，嚴(yán)格的要求，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)，全心全意為人民服務(wù)的精神;通過帶領(lǐng)中學(xué)生為軍烈屬上門服務(wù)，感受軍人和軍人家庭為祖國(guó)和人民安寧作出的犧牲和奉獻(xiàn)，培養(yǎng)中學(xué)生的國(guó)防意識(shí)和長(zhǎng)大保衛(wèi)祖國(guó)的公民責(zé)任感。
2.祭奠英雄人物
在這一天，全軍將會(huì)舉辦各種活動(dòng)來慶祝他們自己的活動(dòng)。有的在部隊(duì)舉辦文藝演出，展示他們的才能;有的則到社區(qū)訪問孤寡老人，為他們獻(xiàn)上一份親情般的溫暖;而有的則會(huì)到革命烈士陵園掃墓或者進(jìn)行網(wǎng)上祭奠，以此來紀(jì)念那些為革命、為人民獻(xiàn)出寶貴生命的英雄人物。
在八一建軍節(jié)這天的掃墓活動(dòng)中，不像清明節(jié)時(shí)的嚴(yán)肅和莊重，他們一般會(huì)在碑墓前舉行一些紀(jì)念活動(dòng)，與其說是表示對(duì)革命先輩悶得的崇敬與懷念，倒不如說是為了紀(jì)念他們的功績(jī)和對(duì)當(dāng)下幸福生活的珍惜。祭奠時(shí)的程序和清明節(jié)掃墓差不多，一般會(huì)有打掃、供奉水果佳肴，或植樹、獻(xiàn)花圈、致禱詞等，隨后有的軍人部隊(duì)還會(huì)去拜訪先烈們的家屬，從前輩的人那里聆聽教誨。與進(jìn)行實(shí)地紀(jì)念不同的時(shí)，在科技發(fā)達(dá)的現(xiàn)今社會(huì)，他們還可以通過互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行網(wǎng)上祭奠，這也是未來掃墓祭奠活動(dòng)的必然趨勢(shì)。
總之，建軍節(jié)的節(jié)日習(xí)俗多種多樣，但最重要和最有意義的當(dāng)屬祭奠活動(dòng)了。
3.看望慰問老同志
走訪慰問軍隊(duì)離退休老同志老干部，向他們致以節(jié)日的問候和良好的祝愿。
為他們送上節(jié)日的問候，對(duì)軍隊(duì)老同志們?cè)诟锩鼞?zhàn)爭(zhēng)年代所作出的貢獻(xiàn)以及長(zhǎng)期以來對(duì)地方經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的關(guān)心支持表示感謝，祝愿他們健康長(zhǎng)壽、晚年幸福、合家歡樂。詢問老同志們的身體、生活狀況，并希望老同志們一如既往地支持我市的各項(xiàng)工作，為經(jīng)濟(jì)建設(shè)和各項(xiàng)社會(huì)事業(yè)的發(fā)展建言獻(xiàn)策。
也希望老同志們把市委、市政府的關(guān)懷轉(zhuǎn)化為動(dòng)力，全力支持地方經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展，為社會(huì)經(jīng)濟(jì)平穩(wěn)發(fā)展發(fā)揮自己的優(yōu)勢(shì)。
4.為貧困家庭獻(xiàn)愛心
【關(guān)鍵詞】計(jì)算機(jī)；素質(zhì)教育；應(yīng)用
一、提高教員自身素質(zhì)是素質(zhì)教育的關(guān)鍵
作為軍校的教育工作者，自身素質(zhì)得不到較大提高，學(xué)員的素質(zhì)提高就困難、緩慢，只有高素質(zhì)的教員才有可能培養(yǎng)出高素質(zhì)的學(xué)員。在計(jì)算機(jī)教育中實(shí)施素質(zhì)教育，提高教員自身素質(zhì)要先行。首先，教員要徹底轉(zhuǎn)變教育理念，充分意識(shí)到計(jì)算機(jī)教育是全面培養(yǎng)學(xué)員素質(zhì)的一門重要學(xué)科。其次，要不斷豐富計(jì)算機(jī)專業(yè)知識(shí)和綜合文化知識(shí)，以完成對(duì)學(xué)員專業(yè)技能的培養(yǎng)，進(jìn)而全面發(fā)展學(xué)員的其它素質(zhì)。最后，要具有改革創(chuàng)新精神，并且勇于改革創(chuàng)新，革除舊的教育思想，才能真正將素質(zhì)教育融入計(jì)算機(jī)教學(xué)，建立起相應(yīng)的素質(zhì)教育運(yùn)行機(jī)制并全面推行，培養(yǎng)出高素質(zhì)的合格士官人才。
二、激發(fā)學(xué)員課堂學(xué)習(xí)熱情，增強(qiáng)主動(dòng)學(xué)習(xí)能力
軍校的教學(xué)軍事色彩濃重，制式化規(guī)范化使學(xué)員學(xué)習(xí)起來很容易困倦，所以教員要以豐富多彩的形式和新穎的方法激發(fā)并保持學(xué)員的學(xué)習(xí)興趣和求知欲望。興趣、動(dòng)機(jī)、意志、情感，這些非智力因素對(duì)認(rèn)知過程起著始動(dòng)、維持和調(diào)節(jié)的功能，它在學(xué)員的學(xué)習(xí)過程中如果受阻或中斷，抑制或減弱，就會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知活動(dòng)無法向縱深發(fā)展而緩慢進(jìn)行，認(rèn)知活動(dòng)能力水平不能充分發(fā)揮出來，從而影響學(xué)員學(xué)習(xí)效果。例如一個(gè)智力因素良好但缺乏學(xué)習(xí)興趣的學(xué)員是不可能取得優(yōu)良的學(xué)習(xí)成績(jī)的?？梢姡虒W(xué)的各環(huán)節(jié)中要始終注意創(chuàng)設(shè)能夠調(diào)動(dòng)和發(fā)揮學(xué)員的非智力因素，使其保持學(xué)習(xí)主動(dòng)性、積極性。具體做法是：1.激發(fā)學(xué)員的學(xué)習(xí)動(dòng)機(jī)。教員要發(fā)揮特長(zhǎng)開動(dòng)腦筋，使學(xué)員產(chǎn)生內(nèi)在的學(xué)習(xí)需求，使其具有明確的學(xué)習(xí)目的和正確的學(xué)習(xí)態(tài)度。2.激發(fā)學(xué)習(xí)熱情。愛因斯坦說過：“把學(xué)生的熱情激發(fā)起來，那么學(xué)校所規(guī)定的功課，就會(huì)被當(dāng)作一種禮物來接受”。就士官學(xué)員的心理特征和年齡來看，正處于心理和身體生長(zhǎng)發(fā)育期好奇心比較重，一般說來對(duì)他們學(xué)習(xí)起主要作用的很大程度上是興趣，因此，在教學(xué)過程中，教員有一個(gè)非常重要的任務(wù)就是培養(yǎng)學(xué)員的興趣。這就要求教員在問題的引入和講解的設(shè)計(jì)上多用心思。根據(jù)計(jì)算機(jī)學(xué)科的特點(diǎn)，教員還可以向?qū)W員介紹計(jì)算機(jī)知識(shí)在日常生活、科技領(lǐng)域的應(yīng)用，結(jié)合教學(xué)的相關(guān)內(nèi)容來解決實(shí)際的問題，讓學(xué)員知道計(jì)算機(jī)在作戰(zhàn)以外的實(shí)用性，從另外一個(gè)角度來激發(fā)學(xué)員的學(xué)習(xí)熱情。3.激發(fā)學(xué)習(xí)情感。要重視情感在學(xué)生發(fā)展中的作用。以情促知，以知導(dǎo)行，情知行互獲，三者相結(jié)合，取得最佳的教學(xué)效果。4.培養(yǎng)學(xué)習(xí)習(xí)慣。教員要指導(dǎo)學(xué)員學(xué)會(huì)學(xué)習(xí)，并逐步養(yǎng)成自主學(xué)習(xí)的習(xí)慣，形成自主學(xué)習(xí)的能力，這樣才能產(chǎn)生學(xué)習(xí)的積極性。
三、從“教會(huì)學(xué)員計(jì)算機(jī)知識(shí)”轉(zhuǎn)向“教會(huì)學(xué)員學(xué)習(xí)計(jì)算機(jī)知識(shí)”
計(jì)算機(jī)是一門操作性很強(qiáng)的學(xué)科，要針對(duì)計(jì)算機(jī)學(xué)科的特點(diǎn)，注重培養(yǎng)學(xué)員實(shí)踐動(dòng)手的操作能力。教員在做演示講解時(shí)，要注意引導(dǎo)學(xué)員有目的地觀察，認(rèn)真觀察操作步驟，理清操作步驟，嚴(yán)格按操作規(guī)則操作，但不是對(duì)知識(shí)的復(fù)制，更應(yīng)該創(chuàng)造性地解決操作問題?，F(xiàn)代的戰(zhàn)爭(zhēng)是信息化戰(zhàn)爭(zhēng)，每個(gè)戰(zhàn)士都應(yīng)該掌握計(jì)算機(jī)操作的知識(shí)，但戰(zhàn)爭(zhēng)又是講究配合、提倡合作。一個(gè)不懂得合作而單打獨(dú)斗的人，是不能完全適戰(zhàn)爭(zhēng)需要的。在計(jì)算機(jī)領(lǐng)域，更是如此。從Windows操作系統(tǒng)到網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，計(jì)算機(jī)上用到的軟件，很少只是依靠一個(gè)人的力量編寫出來的。因此，在計(jì)算機(jī)實(shí)際教學(xué)中，更應(yīng)該培養(yǎng)學(xué)員合作意識(shí)與戰(zhàn)友相互配合的態(tài)度。
四、給學(xué)員創(chuàng)造充分發(fā)展智力因素的自主學(xué)習(xí)空間
教員講一步操作方法，學(xué)員模仿操作一遍的講解實(shí)習(xí)法，嚴(yán)重地束縛了學(xué)員的手腳和制約了學(xué)員的思維方式，使學(xué)員處于被動(dòng)接受知識(shí)的狀態(tài)，訓(xùn)練技能也是被動(dòng)的，不利于發(fā)揮學(xué)員的主動(dòng)性和積極性，無法使學(xué)員智力、個(gè)性得到充分發(fā)展。而自主操作模式采用問題教學(xué)法，通過實(shí)習(xí)任務(wù)來組織教學(xué)，推進(jìn)教學(xué)的進(jìn)程。利用新奇的啟發(fā)性的問題去激發(fā)學(xué)員的求知欲和操作興趣，為學(xué)員創(chuàng)造了一個(gè)充分發(fā)展其觀察力、理解力、分析力、記憶和想象力的自主學(xué)習(xí)的良好空間。引導(dǎo)學(xué)員通過積極的創(chuàng)造思維去解決問題，在解決問題的活動(dòng)中發(fā)展學(xué)員的智力，提高學(xué)員獨(dú)自發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力。
五、實(shí)施素質(zhì)教育應(yīng)積極開展課外活動(dòng)和技能競(jìng)賽
