時間：2022-07-04 19:43:12
序論：在您撰寫醫(yī)學(xué)實踐論文時，參考他人的優(yōu)秀作品可以開闊視野，小編為您整理的7篇范文，希望這些建議能夠激發(fā)您的創(chuàng)作熱情，引導(dǎo)您走向新的創(chuàng)作高度。
實踐小組共24名同學(xué)又分為7個小組，在白鶴社區(qū)及其周邊的6個醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)站點實習(xí)。每個小組3~4個組員，有一個小組長帶領(lǐng)，在一個站點實習(xí)2~3天后，換到另一站點，這樣依次輪轉(zhuǎn)，整個實習(xí)為期10天。6個服務(wù)點分別是白鶴醫(yī)院、丹頂鶴衛(wèi)生服務(wù)站、丹鳳衛(wèi)生服務(wù)站、孔雀衛(wèi)生服務(wù)站、兒童保健科和防治保健科。
白鶴醫(yī)院實踐的同學(xué)主要在內(nèi)科實習(xí)，他們?yōu)榍皝砭驮\的患者提供最基本的服務(wù)，如量血壓等，同時做老師的助手，有時也做一些護理工作。星期一有個中暑病人昏倒后前來就診，我們的一位同學(xué)協(xié)助老師參與搶救，及時有效地替病人緩解癥狀，為老師進一步治療爭得時間。還有一些老年病人往往行動不便，同學(xué)們就會上前攙扶，領(lǐng)他們配藥，注射等。這些都得到了病人和家屬的稱贊，雖然比較辛苦，但我們無比自豪，因為這一點一滴都是為人民服務(wù)，是自身價值的體現(xiàn)，是無私愛心的奉獻。
在丹頂鶴衛(wèi)生服務(wù)站實習(xí)的同學(xué)們?yōu)椴∪肆垦獕骸y體溫，做一些基本的護理，為他們解答一些日常生活健康方面的問題等。通過實習(xí)，我們對醫(yī)生的角色有了更進一步的了解，醫(yī)生惟有具有技術(shù)、責(zé)任和愛心才能成為受患者愛戴和尊敬的好醫(yī)生，才能不辜負病人對醫(yī)生的期望，才能對得起病人把生命都托付給醫(yī)生的這種信任，才能對得起醫(yī)生這個稱號。看到現(xiàn)在這么多病人受慢性病的折磨和一些不治之癥，我感到醫(yī)生們?nèi)沃囟肋h，而這就是我們將來的使命，是我們?nèi)舾赡旰蟮纳袷ヂ氊?zé)。社區(qū)醫(yī)生們和藹耐心的態(tài)度，細致認真的工作為我們樹立一個又一個的好榜樣，那天在丹頂鶴站，醫(yī)生聽到急忙前來的家屬說90多歲的老人躺在家很不舒服，他急忙拎起醫(yī)藥箱，頂著烈日出診，這些也為我們提供了一個活生生的醫(yī)德教育的課堂。丹鳳和孔雀衛(wèi)生服務(wù)站也是為其鄰近居民解決常見健康問題，同學(xué)們在那邊也受益匪淺。
兒童保健科是專門面向兒童，為他們在成長過程中有效地預(yù)防各種易發(fā)病提供咨詢，保健服務(wù)，并為了保證兒童健康成長，在飲食，營養(yǎng)，睡眠，運動等各方面給予各種建議，指導(dǎo)家長科學(xué)地養(yǎng)育子女。我們在這里了解了兒保科醫(yī)生的工作，他們細心地為每一名兒童建立成長檔案，定期為他們體檢，為家長仔細解釋在養(yǎng)育孩子過程中遇到的各種問題。
防治保健科是提供疫苗接種服務(wù)為主的站點，接種各種計劃內(nèi)疫苗和自費疫苗，來接種的大都是一些兒童，防保科為每個兒童建立數(shù)字化資料，并及時通過各種方式通知家長帶領(lǐng)孩子前來接種。我們在防保科了解了各種疫苗種類、接種時間、接種次數(shù)，也幫助那里的老師整理接種記錄等資料，建立傳染病報告等檔案，是老師們的得力助手，得到老師們的一致贊揚。
一、醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會實踐與志愿服務(wù)工作的內(nèi)容和模式分析
（一）醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會實踐與志愿服務(wù)工作的內(nèi)容
社會實踐與志愿服務(wù)工作主要是根據(jù)學(xué)生所學(xué)醫(yī)學(xué)專業(yè)的特點，為醫(yī)院患者或者社區(qū)群眾開展衛(wèi)生宣傳教育和衛(wèi)生診療服務(wù)等，從而提高學(xué)生將自身的專業(yè)知識運用到實踐的能力，以便為社會和群眾提供更多的服務(wù)。社會實踐與志愿服務(wù)工作的內(nèi)容主要為圍繞醫(yī)學(xué)知識宣講和醫(yī)療服務(wù)等方面開展。
（二）醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會實踐與志愿服務(wù)工作的模式
1.參觀教育模式。學(xué)校組織醫(yī)學(xué)生到一些大型的醫(yī)院中進行參觀，主要包括醫(yī)生的診治過程、手術(shù)過程等觀察，讓醫(yī)學(xué)生充分認識到醫(yī)療工作的重要性，切實提高廣大醫(yī)學(xué)生的敬業(yè)精神。
2.服務(wù)奉獻模式。組織廣大醫(yī)學(xué)生深入敬老院、福利院、孤兒院、兒童聾啞學(xué)校等社會福利組織中，為這些人群開展各項醫(yī)療和衛(wèi)生服務(wù)工作，從而幫助他們切身感受到這些特殊人群生活的疾苦，不斷提高醫(yī)學(xué)生的道德素養(yǎng)。
3.專題調(diào)研模式。在導(dǎo)師的帶領(lǐng)下，將醫(yī)學(xué)生劃分成若干專題研究小組，主要進行對醫(yī)學(xué)的研討和社會調(diào)查活動等等，主要是為了培養(yǎng)廣大醫(yī)學(xué)生社會認知能力和科學(xué)研究能力[1]。4.其他模式。醫(yī)學(xué)類大學(xué)生開展社會實踐與志愿服務(wù)的模式還包括送藥、送醫(yī)以及送衛(wèi)生知識下鄉(xiāng)等。
二、醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會實踐和志愿服務(wù)工作模式存在的問題
（一）社會實踐和志愿服務(wù)工作模式單一
當(dāng)前醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會實踐和志愿服務(wù)工作模式相對單一，主要是以下兩個原因：一是個別學(xué)生參與社會實踐和志愿服務(wù)的積極性不高；二是個別醫(yī)學(xué)院還不能充分意識到社會實踐和志愿服務(wù)工作的重要性，并缺乏針對社會實踐和志愿服務(wù)考核體系，不能在醫(yī)學(xué)生中產(chǎn)生較大的教育意義。
（二）社會實踐和志愿服務(wù)脫離實際
從當(dāng)前個別醫(yī)學(xué)院開展的社會實踐和志愿服務(wù)工作來看，很多都是根據(jù)教學(xué)課程安排的需要，缺乏將社會實踐和志愿服務(wù)跟實際有效結(jié)合起來。
（三）社會實踐和志愿服務(wù)專業(yè)性不強
個別醫(yī)學(xué)院的組織者在開展社會實踐和志愿服務(wù)過程中不能有效將活動內(nèi)容跟學(xué)生的專業(yè)、社會熱點的話題充分結(jié)合起來。
三、提高醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會實踐和志愿服務(wù)區(qū)的效果的重要途徑
（一）加強社會實踐和志愿服務(wù)的宣傳工作
作為醫(yī)學(xué)院，要充分利用社會媒體加強對醫(yī)學(xué)生社會實踐和志愿服務(wù)的宣傳力度，從而幫助社會及時了解醫(yī)學(xué)生參與社會實踐和志愿服務(wù)的重要性，進一步為學(xué)生參與社會實踐和志愿服務(wù)創(chuàng)造良好的氛圍。另外，醫(yī)學(xué)院還應(yīng)該充分利用自身的校園網(wǎng)、宣傳欄、廣播等宣傳在社會實踐和志愿服務(wù)表現(xiàn)突出的團體和個人，從而充分調(diào)動學(xué)生參與社會實踐和志愿服務(wù)的積極性和熱情。
（二）豐富社會實踐和志愿服務(wù)的模式
由于低年級的醫(yī)學(xué)生自身的專業(yè)知識有限，業(yè)余時間少，學(xué)校在組織這部分學(xué)生參與社會實踐和志愿服務(wù)時應(yīng)該進一步創(chuàng)新社會實踐和志愿服務(wù)的模式，在充分整合社會和校園的各方資源的基礎(chǔ)上，為其創(chuàng)造一個相對穩(wěn)定的醫(yī)學(xué)生實踐基地，并建立起具有醫(yī)學(xué)生社會實踐和志愿服務(wù)特色的創(chuàng)新機制，充分培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生的組織、協(xié)調(diào)以及溝通能力[2]。
（三）加強社會實踐和志愿服務(wù)制度建設(shè)
組織廣大醫(yī)學(xué)類大學(xué)生參與社會實踐和志愿服務(wù)不但可以幫其深入基層、了解社會，還可以提高他們的專業(yè)知識。因此醫(yī)學(xué)院應(yīng)該進一步加強醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會實踐和志愿服務(wù)工作的制度建設(shè)，爭取從動員——申報立項——時間團隊資料審批——實踐團長安全教育整個過程能夠得到有效的監(jiān)督和指導(dǎo)，提高醫(yī)學(xué)生社會實踐和志愿服務(wù)工作的效果。
總結(jié)
ExpressionandbiologicalactivityofmouseWnt3ageneinNIH3T3cells
【Abstract】AIM:ToexpressrecombinantmouseWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.METHODS:Therecombinanteukaryoticexpressionplasmid,pSecTag2/HygroBWnt3a,wastransfectedintoNIH3T3cellsbyliposome,thentheexpressedproteinwasdetectedbyWesternBlot.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellswereevaluated.RESULTS:TheWnt3asignalproteinwasstablyexpressedinWnt3a/NIH3T3cells.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellsweremarkedlyincreased.CONCLOUSION:WesuccessfullyconstructtherecombinantWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.
【Keywords】Wnt3a;eukaryoticexpression;contactinhibition;apoptosis
【摘要】目的：表達具備生物活性的重組小鼠Wnt3a信號蛋白.方法：應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組真核表達載體pSecTag2/HygroBWnt3a轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定表達的NIH3T3細胞，WesternBlot鑒定重組Wnt3a蛋白的表達，并對Wnt3a/NIH3T3細胞的融合密度及抗凋亡能力給予檢測.結(jié)果：Wnt3a信號蛋白在Wnt3a/NIH3T3細胞中獲得穩(wěn)定表達，Wnt3a信號蛋白能夠明顯提高NIH3T3細胞的融合密度及抗凋亡能力.結(jié)論：在NIH3T3細胞中表達的重組Wnt3a信號蛋白具備生物活性.
【關(guān)鍵詞】Wnt3a；真核表達；接觸抑制；細胞凋亡
0引言
小鼠Wnt3a基因是Wnt基因家族中的重要成員，其編碼表達Wnt3a信號蛋白.Wnt3a信號蛋白可以激活經(jīng)典的Wnt/βcatenin信號通路.Wnt3a信號蛋白對神經(jīng)干細胞表現(xiàn)出明顯的促神經(jīng)元分化的作用.我們應(yīng)用基因重組的方法，從小鼠胚腦中克隆Wnt3acDNA，構(gòu)建真核表達載體，通過陽離子脂質(zhì)體試劑將目的基因?qū)隢IH3T3細胞中，建立穩(wěn)定表達Wnt3a信號蛋白的NIH3T3細胞株，并對其生物學(xué)活性進行初步分析.
1材料和方法
1.1材料真核表達載體pSecTag2/HygroBWnt3a由本研究室構(gòu)建.NIH3T3細胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)病理教研室吳強教授惠贈.多聚賴氨酸購自博士德公司；胎牛血清及DMEM購自Gibco公司.潮霉素及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、購自Invitrogen公司.質(zhì)粒小量提取試劑盒WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationsystem,ReverseTranscriptionSystemRTPCR試劑盒購自Promega公司；鼠抗mycmAb、鼠抗βcateninmAb購自SantaCruz公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗、TRITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗購自北京中山公司；臺盼藍購自sigma公司.其他試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純.
1.2方法
1.2.1NIH3T3細胞的培養(yǎng)將凍存的NIH3T3細胞復(fù)蘇后用含100g/L的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d換液1次,傳代3至4次使細胞達到良好的生長狀態(tài).
1.2.2NIH3T3細胞的轉(zhuǎn)染按LipofectamineTM2000試劑說明書操作進行.轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶消化貼壁的NIH3T3細胞，再以無血清及無雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸，并按1×105的細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，當(dāng)細胞生長至85%～90%融合度時，取純化的重組質(zhì)粒pSecTag2/HygroBWnt3a2μg，溶于250μL無血清的DMEM培養(yǎng)基中，得到A液.取3μLLipofectamineTM2000加于97μL無血清的DMEM培養(yǎng)基中，得到B液.將A,B液混勻，室溫放置30min后加入0.8mL含100g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，均勻滴加于經(jīng)無血清培養(yǎng)基洗滌的貼壁細胞表面，于37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.棄去轉(zhuǎn)染液，加2mL完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).轉(zhuǎn)染后48h，待細胞生長至接近融合時收集上清，并按1∶3的密度傳代.繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度達50%～70%.棄去培養(yǎng)液，更換濃度為600mg/L的潮霉素培養(yǎng)液進行篩選.轉(zhuǎn)染時，設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體pSecTag2/HygroB的組和正常細胞陰性對照組.約14d后，可見有陽性克隆形成，繼續(xù)擴增培養(yǎng).穩(wěn)定表達Wnt3a蛋白的細胞株命名為Wnt3a/NIH3T3（W/3T3），轉(zhuǎn)染空載體的細胞株命名為empty/NIH3T3（E/3T3），正常細胞陰性對照組命名為control/NIH3T3（C/3T3）.
1.2.3重組Wnt3a蛋白鑒定轉(zhuǎn)染48h后，分別收集C/3T3,E/3T3和W/3T3細胞各約1×106及其培養(yǎng)上清液.以SDS煮沸法裂解細胞并收集上清，并將其與細胞培養(yǎng)上清液真空冷凍干燥，濃縮至1/2體積，以鼠抗mycmAb為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，使用WesternBlot方法行重組Wnt3a蛋白的鑒定.
1.2.4βcatenin的表達鑒定分別在轉(zhuǎn)染后6,12,24h收集W/3T3,E/3T3及C/3T3細胞各約1×106，以SDS煮沸法裂解細胞并收集上清，以鼠抗βcateninmAb為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，使用WesternBlot方法進行鑒定.
1.2.5Wnt3a/NIH3T3細胞增殖特性的鑒定以密度約1×105接種W/3T3,E/3T3及C/3T3細胞于24孔培養(yǎng)板，隔日觀察，臺盼藍染色并使用血細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞.
1.2.6Wnt3a/NIH3T3細胞抗凋亡實驗以密度約1×105接種W/3T3,E/3T3及C/3T3細胞于24孔培養(yǎng)板，24h后臺盼藍染色并使用血細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞數(shù)，同時更換含10g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，定時觀察并臺盼藍染色并使用血細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞，計算存活細胞與原始細胞數(shù)的比值.
統(tǒng)計學(xué)處理：用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析.
2結(jié)果
2.1重組Wnt3a蛋白在的NIH3T3細胞中獲得表達WesternBlot鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a基因的NIH3T3細胞裂解液中有一Mr約為45×103的特異性條帶，在轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a基因的NIH3T3細胞培養(yǎng)上清液、E/3T3及C/3T3細胞裂解液和細胞培養(yǎng)上清液中，均未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)條帶(圖1).
1:W/3T3組細胞裂解液；2：W/3T3組細胞培養(yǎng)上清液；3：E/3T3組細胞裂解液；4：C/3T3組細胞裂解液.
圖1WestemBlot鑒定Wnt3a信號蛋白的表達（略）
2.2Wnt3a/NIH3T3細胞中βcatenin的表達上調(diào)對Wnt信號通路中的重要信息分子βcatenin的表達情況進行WesternBlot鑒定，在Mr約90×103處出現(xiàn)特異性條帶(圖2)，但無時間依賴性.
1~3:培養(yǎng)6,12,24h.
圖2各實驗組βcatenin表達（略）
2.3Wnt3a/NIH3T3細胞融合密度明顯增高經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)活細胞，以密度約1×105接種的E/3T3及C/3T3細胞3d后生長至融合密度，此時細胞融合密度約4.6×105，但W/3T3細胞繼續(xù)生長至第6d，細胞融合密度約13×105，與另外兩組相比，W/3T3細胞融合密度明顯增高（P<0.01）(圖3，4).
A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.
圖3各實驗組細胞融合密度觀察(倒置×100)（略）
2.4W/3T3細胞抗凋亡能力明顯增高經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)活細胞，更換含10g/L胎牛血清的培養(yǎng)液48h后，E/3T3及C/3T3細胞大量凋亡，細胞數(shù)明顯減少，但W/3T3細胞數(shù)無明顯減少，抗凋亡能力明顯提高（P<0.01）(圖5，6).
圖4實驗組細胞數(shù)變化（略）
A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.
圖5各實驗組細胞抗凋亡能力觀察(倒置×100)（略）
圖6實驗組存活細胞比例（略）
3討論
Wnt信號蛋白為含有23～24個保守型半胱氨酸殘基,在人類的基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Wnt基因19種［1-2］.Wnt3a是Wnt基因家族的重要成員，其基因早在1992年就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，而且多種的真核細胞被用于它的表達，但由于其低溶解度及疏水性等特點，一直未能純化出具備生物活性的Wnt3a信號蛋白.1998年，Shibamoto等［3］使用L細胞（鼠胸腺激酶缺陷細胞株；LMTK）作為表達細胞時，在培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)了大量具備生物活性的Wnt3a蛋白，約400μg/L.Willert等［4］所純化的Wnt3a信號蛋白通過激活Wnt信號通路促使骨髓中的造血干細胞分裂和自我復(fù)制，認為Wnt可能在一系列組織的自我更新中起信號作用.
βcatenin是經(jīng)典的Wnt/βcatenin信號通路中重要的信息分子［5］，其在Wnt信號通路關(guān)閉的情況下，βcatenin被磷酸化而迅速降解.Wnt信號通路被激活后，βcatenin在胞內(nèi)大量聚集，并進入細胞核，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng).βcatenin表達的明顯上調(diào)代表Wnt信號通路被激活.實驗中WesternBlot鑒定發(fā)現(xiàn)βcatenin表達明顯上調(diào)，但沒有發(fā)現(xiàn)與時間有依賴關(guān)系.實驗中表達的重組Wnt3a信號蛋白帶有myc標(biāo)簽，Burrus等［6］認為如果Wnt3a信號蛋白帶有標(biāo)簽將影響其活性，甚至失活.但同樣有文獻［7,8］中應(yīng)用的Wnt3a信號蛋白帶有myc,HA等標(biāo)簽，而且文獻中對其活性同樣做了詳細的描述.本實驗夠構(gòu)建的重組Wnt3a信號蛋白具備生物學(xué)活性，但未能與野生型（wildtype）Wnt3a信號蛋白活性做詳細的比較，其生物學(xué)活性的變化有待進一步分析.
Wnt3a蛋白可以促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化.在使用含有Wnt3a信號蛋白的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)E11.5d的胎鼠前腦神經(jīng)干細胞發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞大量分化成為MAP2陽性的神經(jīng)元.去除Wnt3a信號蛋白后，神經(jīng)干細胞恢復(fù)增殖能力，而且當(dāng)條件培養(yǎng)液中的FGF2去除后，分化的神經(jīng)元形態(tài)更為成熟［8-9］.來源于小鼠大腦皮質(zhì)的神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)基因后超表達Wnt信號蛋白，即使在培養(yǎng)液中加入FGF2，依然大量向神經(jīng)元分化，但阻斷Wnt信號通路后神經(jīng)元的分化被抑制［10］.
Wnt信號通路的生物學(xué)作用十分復(fù)雜，不同的Wnt基因，不同的細胞，甚至不同的細胞狀態(tài)都有可能產(chǎn)生不同的作用［11］.在本實驗中我們采用pSecTag2/HygroBWnt3a真核表達載體，NIH3T3細胞作為表達細胞，成功表達重組Wnt3a信號蛋白，初步探討了Wnt3a信號蛋白的生物學(xué)活性，為進一步建立用于以治療為目的的分子移植的方法奠定基礎(chǔ).
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EffectsofoctylphenoloncellcycleandcyclinexpressionofMDAMB231breastcancercells
【Abstract】AIM:Toobservetheeffectsofoctylphenol(OP)oncellcycleandcyclinexpressionofMDAMB231breastcancercellsandtoprobethemolecularmechanismsofOPinhibitingMDAMB231breastcancercellproliferation.METHODS:Thechangesofcellproliferation,cellcycle,cyclinD1mRNA,cyclinD3mRNA,CDK2mRNA,CDK4mRNAandcyclinD1proteinexpressionsofMDAMB231cellstreatedwithOPwereobservedbyusingMTTtest,flowcytometry,immunocytochemistryandRTPCR.RESULTS:WhenMDAMB231breastcancercellsweretreatedwith4or8μmol/LOPfor48h,thecellinhibitionrateswere(17.13±4.1)%,(40.25±8.7)%,andthefluorescencevaluesofcyclinD1were55.1±10.2,41.4±11.2,significantlydecreasedascomparedwithcontrolgroup(89.9±11.2,P<0.05).WhenMDAMB231breastcancercellsweretreatedwith8μmol/LOPfor24and72h,thecellratiosintheG0/G1phasewere(67.0±17.6)%and(44.4±11.9)%，significantlyincreasedascomparedwithcontrolgroup［(46.6±12.8)%at24h,(15.3±3.1)%at72h,P<0.05］.OPinhibitedthemRNAexpressionsofcyclinD1,cyclinD3,CDK2andCDK4andtheproteinexpressionofcyclinD1.CONCLUSION：OPcaninhibittheproliferationofMDAMB231breastcancercells,whichmayberelatedtodownregulatingtheexpressionsofcyclinD1,cyclinD3,CDK2andCDK4mRNAandcyclinD1protein.
【Keywords】cellproliferation;breastneoplasms;octylphenol;cyclinD1；cylindependentkinases
【摘要】目的:觀察辛基酚(OP)對細胞周期及周期蛋白表達的影響，探討OP抑制MDAMB231乳腺癌細胞增殖的可能分子機制.方法：以MTT試驗、流式細胞分析、免疫細胞化學(xué)和RTPCR等方法觀察OP對MDAMB231乳腺癌細胞增殖、細胞周期、CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3表達的影響.結(jié)果：4,8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細胞48h時，其抑制率為(17.1±4.1)%,(40.3±8.7)%，cyclinD1表達量熒光值為55.1±10.2，41.4±11.2，比對照組(89.9±11.2)明顯降低(P<0.05).8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細胞24h和72h，G0/G1期細胞為(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期細胞比對照組［24h，(46.6±12.8)%；72h，(15.3±3.1)%］明顯增高(P<0.05).OP導(dǎo)致MDAMB231乳腺癌細胞中CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3mRNA的表達降低，且cyclinD1蛋白的表達也降低.結(jié)論：OP能抑制MDAMB231乳腺癌細胞增殖，其機制可能與OP能降低乳腺癌細胞中CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3mRNA及其蛋白的表達有關(guān).
【關(guān)鍵詞】細胞增殖;乳腺癌;辛基酚；細胞周期蛋白D1;細胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶類
0引言
辛基酚（octylphenols,OP）是一種環(huán)境雌激素，近年來對它的雌激素活性檢測及其生殖毒性效應(yīng)研究較多［1］.OP能促進ERα+MCF7乳腺癌細胞的增殖，表現(xiàn)雌激素活性，卻抑制ERα-MDAMB231乳腺癌細胞的增殖［2］.細胞增殖與細胞周期密切相關(guān)，本研究將OP作用于MDAMB231乳腺癌細胞，觀察細胞的增殖和CDK2,CDK4,cyclinD1，cyclinD3表達的改變，探討OP影響MDAMB231乳腺癌細胞增殖的作用機制.
1材料和方法
1.1材料試劑中，OP純度>98%，sigma產(chǎn)品.cyclinD1抗體為兔抗人抗體，使用濃度為1∶75倍稀釋，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔抗體，北京中杉產(chǎn)品.RTPCR試劑盒，上海sangon產(chǎn)品.二甲亞砜(DMSO)，純度>98%，進口分裝試劑，用于配制OP.MDAMB231乳腺癌細胞由中科院上海細胞所提供.實驗前將MDAMB231乳腺癌細胞在無酚紅的DMEM/F12中培養(yǎng)24h以耗盡細胞的內(nèi)源性雌激素，然后以該培養(yǎng)基進行實驗.實驗分為3組：對照組，給予DMSO；4μmol/LOP組；8μmol/LOP組.
1.2方法
1.2.1MTT試驗以492nm波長測定活細胞的吸光度（A），抑制率（PR）=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%，每次試驗設(shè)2個平行孔，試驗重復(fù)3次［3］.
1.2.2細胞周期相及凋亡檢測實驗各組細胞處理24,48和72h，收獲細胞，700mL/L冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶(PI)染色，流式細胞儀檢測，每次試驗設(shè)2個平行孔，試驗重復(fù)3次.
1.2.3cyclinD1表達分析細胞生長于小蓋玻片上，多聚甲醛固定，血清封閉，加一抗于37℃孵育50min，加熒光素標(biāo)記二抗孵育20min，甘油封片，LeicaNT激光共聚焦顯微鏡觀察、照相及數(shù)據(jù)分析，實驗重復(fù)2次.計算熒光強度時每組實驗取3張片子，每張片子取36個視野，每個視野取5個細胞，計算其平均熒光強度.
1.2.4RTPCR檢測CDK2,CDK4,cyclinD1,cyclinD3的mRNA表達實驗各組細胞處理24h，收獲細胞，用Trizol試劑一步法提取各組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-80℃?zhèn)溆?引物由上海sangon合成，CDK2：F5′GCTCTCACTGGCATTCCTCCT3′，R5′5′CGAAATGAAGGCACTAGAGC3′，產(chǎn)物546bp；CDK4：F5′CTACCTCTCGATATGAGCCAGT3′，R5′CATCTGGTAGCTGTAGATTCTG3′，產(chǎn)物563bp；cyclinD1：F5′GAGGAACAGAAGTGCGAGGA3′，R5′TCTGGAGAGGAAGCGTGTGA3′，產(chǎn)物501bp；cyclinD3：F5′TGTCAGGAGCAGATCGAAGC3′，R5′CCTTTAGAAGGCACTAGAGC3′，產(chǎn)物453bp；βactin：F5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′，R5′GGCGGCACCACCATGTACCCT3′，產(chǎn)物202bp.25μL體系加樣本總cDNA，上游和下游引物各1.5μL，依次加入試劑盒其他成分.反應(yīng)條件為94℃滅活40s，60℃或61℃退火40s，72℃延伸40s，22個循環(huán)，20g/L瓊脂糖電泳，照相，半定量分析以凝膠成像系統(tǒng)的分析軟件Q1來分析其灰度值，每實驗重復(fù)3次，以目的條帶/βactin之比值為結(jié)果，各組間進行單因素方差分析.
統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較用SPSS10.0軟件進行單因素方差分析.
2結(jié)果
2.1MDAMB231乳腺癌細胞增殖以4,8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細胞48h，細胞抑制率為(17.1±4.1)%，(40.3±8.7)%.
2.2MDAMB231乳腺癌細胞周期相分布8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細胞24h和72h，G0/G1期細胞分別為(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期細胞比對照組［24h，(46.6±12.8)%；72h，(15.3±3.1)%］明顯增高(P<0.05).
2.3MDAMB231乳腺癌細胞中cyclinD1蛋白表達cyclinD1蛋白主要表達于細胞的胞漿中(圖1)，4,8μmol/LOP組cyclinD1表達量熒光值分別為55.1±10.2，41.4±11.2，比對照組(89.9±11.2)明顯降低(P<0.05).
A：對照組；B：4μmol/LOP組；C：μmol/LOP.
圖1OP對MDAMB231乳腺癌細胞中cyclinD1表達的影響SPFITC×400（略）
2.4MDAMB231乳腺癌細胞中CDK2,CDK4,cyclinD1,cyclinD3mRNA表達mRNA的表達以電泳條帶的亮度來判斷，亮度值越強，mRNA量越高，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)軟件處理，與對照組比較，OP組CDK2,CDK4,cyclinD1及cyclinD3mRNA表達均降低(圖2).
M:marker;1:8μmol/LOP;2:4μmol/LOP;3:對照.aP<0.05vs對照.
圖2OP對MDAMB231乳腺癌細胞中cyclinD3,cyclinD1,CDK2,CDK4mRNA表達的影響（略）
3討論
雌激素是哺乳動物體內(nèi)分泌的一種性激素，起著調(diào)節(jié)動物生長、分化和生殖的作用.OP是一種苯環(huán)類化合物，能與ERα結(jié)合，顯示出雌激素活性.OP主要用于生產(chǎn)非離子表面活性劑、增塑劑、熱穩(wěn)定劑、光穩(wěn)定劑等，廣泛存在于生活、工作環(huán)境的水體、淤泥、土壤和食物如魚類、貝類及飲用水中［4］.MDAMB231乳腺癌細胞是一株ERα-的細胞，>15μmol/LOP對MCF7乳腺癌細胞會產(chǎn)生毒性作用，1~10μmol/LOP會對MDAMB231乳腺癌細胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)，抑制MDAMB231乳腺癌細胞的增殖［1］.以植物雌激素三羥異黃酮作用184B5/HER細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活細胞數(shù)量減少，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，同時G0/G1期細胞增高，細胞凋亡也增多.本研究結(jié)果顯示4，8μmol/LOP均能抑制MDAMB231乳腺癌細胞增殖，并呈時間效應(yīng)和劑量效應(yīng).
細胞增殖依賴于細胞周期的順利進行，該過程受G1/S，G2/M兩個關(guān)健點調(diào)控.植物雌激素三羥異黃酮能將MDAMB231乳腺癌細胞阻滯于G2/M期，細胞凋亡增加［5］，超二倍體增加.本研究結(jié)果顯示OP作用MDAMB231乳腺癌細胞24h，G0/G1期細胞(凋亡峰)明顯增加(P<0.05)，表明OP具有急性毒性作用，細胞迅速凋亡.OP引起MDAMB231乳腺癌細胞周期阻滯與三羥異黃酮不同，這可能與三羥異黃酮具有多種生物活性有關(guān).
細胞增殖依賴于細胞周期的順利進行，細胞周期的正常進行又依賴于細胞周期調(diào)控蛋白如cyclinD，cyclinA，cyclinE等及細胞周期依賴性激酶(CDK)的正常表達.cyclinDCDK4是G0/G1期的限速步驟，過度表達G1期的周期蛋白如cyclinD，cyclinE能加速細胞快速通過G1期.cyclinD1蛋白表達與細胞周期運行有關(guān)［6］，抑制腫瘤組織生長與P53的高表達及cyclinD1低表達相關(guān)［7］.以17羥雌二醇作用雌性Wistar大鼠60d，發(fā)現(xiàn)雌二醇通過減少CDK2，CDK4的表達以及降低CDK2活性，將細胞阻滯于G1/S期［8］.本研究結(jié)果表明，OP作用MDAMB231乳腺癌細胞后，能降低CDK2,CDK4,cyclinD1及cyclinD3mRNA的表達，降低cyclinD1蛋白的表達，抑制乳腺癌細胞的增殖，細胞阻滯于G1/S期，導(dǎo)致MDAMB231乳腺癌細胞的增殖受抑，并呈劑量效應(yīng)和時間效應(yīng).
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ExpressionofMMP9inskinsquamouscellcarcinomaanditssignificanceinmicroangiogenesis
【Abstract】AIM:TodetecttheroleandthesignificanceofMMP9inmicroangiogenesisinskinsquamouscellcarcinoma(SCC)andtoobservetherelationbetweentheexpressionofMMP9andmicrovesseldensity(MVD)inSCC.METHODS：ImmunohistochemicalSPstainingwasusedtoexamineMMP9expressionandthechangeofMVDunderlightmicroscopein45casesofSCC,19casesofBowendisease,and10casesofnormalskin.RESULTS：TheexpressionofMMP9inSCCgroupwassignificantlyhigherthanthatinBowendiseasegroup（P<0.05）,whilethelatterwasalsosignificantlyhigherthanthatinnormalskingroup（P=0.028，P<0.05）.ThelevelofMVDinSCCgroupwassignificantlyhigherthanthatinBowendiseasegroup（P<0.05）,andthelatterwassignificantlyhigherthanthatinnormalskingroup（P<0.05）.CONCLUSION：MMP9ishighlyexpressedinSCC,andmaybeoneofimportantfactorsinangiogenesisofSCC.
【Keywords】skinneoplasms;carcinoma,squamouscellimmunohistochemistry;gelatinaseB;antigens,CD34;microvesseldensity
【摘要】目的：探討皮膚鱗狀細胞癌（SCC）發(fā)生發(fā)展過程中基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）對微血管生成的意義.方法：SCC45例,Bowen病19例、正常皮膚10例進行CD34,MMP9免疫組化染色.檢測MMP9的表達和微血管密度（MVD）的變化，分析MMP9的表達與MVD之間，及它們與SCC臨床病理特征之間的關(guān)系.結(jié)果：在SCC組中MMP9表達高于Bowen病組（P<0.05）,Bowen病組中MMP9表達高于正常皮膚組（P=0.028,P<0.05）.在SCC組中MVD值高于Bowen病組(P<0.05)，Bowen病組中MVD值高于正常皮膚組（P<0.05）.結(jié)論：MMP9可能是SCC促進微血管生成因子之一，與SCC的侵襲性相關(guān).
【關(guān)鍵詞】皮膚腫瘤；免疫組織化學(xué)；明膠酶B；抗原CD34；微血管密度
0引言
癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力與其誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶降解細胞外基質(zhì)（ECM），基底膜（BM）的能力密切相關(guān).基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是其中最為重要的一組蛋白酶，研究表明［1-2］，MMP對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移起重要的作用.Guttman等［1］研究表明MMPs在腫瘤血管生成中也有重要作用.明膠酶是MMPs的一個亞類，包括基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9），近年MMP9與腫瘤血管生成的關(guān)系逐漸被重視.MMP9不僅是降解基底膜和ECM的關(guān)鍵酶，而且在腫瘤間質(zhì)血管生成中起重要作用.在皮膚鱗癌中，有關(guān)MMP9的研究報道很少，其結(jié)果也不完全一致.我們通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測Bowen病(BD)，鱗狀細胞癌（squamouscellcarcinoma,SCC）組織中MMP9和CD34的表達，并對MMP9的表達與微血管密度（MVD）做定量分析，探討皮膚鱗狀細胞癌、Bowen病、基底細胞癌組織中MMP9對血管生成的作用及其臨床意義.
1材料和方法
1.1材料石蠟包埋組織標(biāo)本選自西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院199901/200605病理確診手術(shù)患者.SCC45例，年齡45～95(平均68.8)歲，男27例，女18例.Bowen病19例，年齡45～87(平均65.2)歲，男12例，女7例.正常人皮膚10例對照，年齡46～78（平均62.5）歲，男5例，女5例作鼠抗人MMP9mAb（MAB0245）和CD34mAb（(MAB0034)，免疫組化SP試劑盒(KIT9710)及DAB試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司.
1.2方法所有組織均經(jīng)40g/L甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，連續(xù)切片5張，厚約4μm.采用SP法，免疫組化染色程序按試劑盒說明書進行.陽性對照采用自身對照,用PBS代替一抗和二抗進行陰性對照.MMP9和CD34均采用高溫高壓抗原修復(fù).MMP9結(jié)果判定：在不知任何背景資料的情形下,采用雙盲法進行判定,以腫瘤細胞膜和/或細胞質(zhì)出現(xiàn)淡棕黃色顆粒為陽性，并按著色強弱分級：無色為0，淺黃色為1，深黃色為2，棕黃色為3；著色范圍以在10×40高倍鏡下隨機選區(qū)5個視野（每個視野記數(shù)100個細胞）計數(shù)陽性細胞所占的百分數(shù)均值：＜25%為1,25%~49%為2，50%為3.上述兩項相加為MMP9的表達強度積分：＜2為陰性，＜3為弱陽性（+），3~4為陽性（），＞4為強陽性（）.MVD計數(shù)參照文獻［3-4］方法進行微血管計數(shù)，先在低倍鏡（×100）下觀察確定血管密度最高處，在（×200）視野下選擇3個高血管密度區(qū)，計算單位視野（×200）平均血管數(shù).單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇，均作為一個血管計數(shù)，而直徑大于約8個紅細胞的血管，有較厚肌層的血管以及硬化區(qū)的血管不在計數(shù)范圍內(nèi).
統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行處理,根據(jù)資料類型組間比較分別采用方差分析和χ2檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義.
2結(jié)果
2.1MMP9MMP9陽性改變?yōu)榧毎|(zhì)或細胞膜呈棕黃色，偶爾可見細胞核著色，陽性顆粒多呈團塊狀.正常人皮膚組織中MMP9呈弱陽性表達，主要表達于顆粒層和棘細胞層，真皮層中纖維樣細胞、單一核細胞等見陽性染色.BD組織中表皮全層均有MMP9均勻彌漫表達.SCC中MMP9在癌巢組織彌漫分布，以腫瘤周邊表達強烈（圖1）MMP9表達在正常皮膚組、Bowen病組、SCC組依次增高（表1）.MMP9在SCC組中高于Bowen病組織（χ2=6.667,P<0.05），Bowen病組中MMP9高于正常皮膚組（P=0.028，P<0.05）.在SCC組中MMP9的表達與患者的年齡、性別、腫瘤組織的病理分級均無關(guān)（P＞0.05）.
表1MMP9在正常皮膚組、Bowen病組和SCC表達(略)
2.2MVD計數(shù)CD34標(biāo)記的微血管呈點狀分布，血管內(nèi)皮細胞膜被染成褐色.在SCC組織中微血管形態(tài)不規(guī)則，部分血管呈現(xiàn)發(fā)芽狀，血管分布不均勻，在SCC的邊緣區(qū)域最為密集，呈簇狀(圖2).Bowen病組織中微血管形態(tài)較規(guī)則，但分布不均，血管簇偶見.正常皮膚組織內(nèi)的微血管形態(tài)規(guī)則，分布均勻.Bowen病組中和SCC組中MVD明顯升高（表3）.
圖1SCC組織MMP9表達SP×400(略)
表2SCC組織MMP9表達與患者年齡、性別及鱗癌分期的關(guān)系(略)
圖2SCC組織MVD計數(shù)SP×100(略)
表3CD34和MVD在Bowen病和SCC中表達(略)
aP<0.05vs正常皮膚.
3討論
本研究結(jié)果顯示,MMP9在SCC組中高于Bowen病組織（P<0.05），Bowen病組中MMP9高于正常皮膚組（P<0.05）.Bowen病MMP9在增生表皮細胞質(zhì)或細胞核表達；在SCC組織中MMP9在腫瘤細胞，增生上皮細胞和間質(zhì)細胞均有陽性表達，在表達的強度、陽性細胞的種類、數(shù)量上均高于Bowen病組，提示MMP9高表達可能是SCC轉(zhuǎn)移、侵襲能力的分子基礎(chǔ).同時觀察到僅有部分有腫瘤細胞能表達MMP9，且表達MMP9的腫瘤細胞多位于癌巢的外周部分和毛細血管、淋巴管管腔周圍，提示MMP9表達的腫瘤細胞可能具有更強的侵襲能力.實體腫瘤的新生血管提供了更多與體循環(huán)連接的通路，這使腫瘤細胞更容易從原發(fā)灶向遠隔部位轉(zhuǎn)移.腫瘤組織中微血管密度越大，腫瘤細胞進入血循環(huán)及淋巴循環(huán)的機會越多，淋巴結(jié)及鄰近臟器轉(zhuǎn)移的機會也增大.在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)：微血管密度與腫瘤侵襲性與腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率相關(guān)［1,5-6］.近來研究表明，MMP9不僅是降解基底膜和ECM的關(guān)鍵酶，而且在腫瘤間質(zhì)血管生成中起重要作用［1，5］.Wang等［7］人的研究表明,存在于細胞外基質(zhì)的VEGF能夠通過存在于血管平滑肌細胞上的VEGFR1受體調(diào)節(jié)MMPs的表達.而MMPs又能降解細胞外基質(zhì)釋放更多的VEGF,這便建立了一個正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路來促進新生血管的形成.Naglich等［8］研究發(fā)現(xiàn)MMP1,MMP2,MMP9誘發(fā)和促進血管生成，TIMP1,TIMP2,TIMP3,TIMP4抑制新血管生成.
本實驗顯示，在SCC組織中微血管形態(tài)不規(guī)則，血管分布不均勻，在SCC的邊緣區(qū)域最為密集，呈簇狀.Bowen病組織中微血管形態(tài)較規(guī)則，但分布不均.正常皮膚組織內(nèi)的微血管形態(tài)規(guī)則，分布均勻.SCC組中MVD高于Bowen病組織（P<0.05），Bowen病組中MVD高于正常皮膚組（P<0.05），提示細胞在發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化之前已有血管生成增多，這很可能是SCC血管生成的啟動階段.我們發(fā)現(xiàn)在SCC組、Bowen病和正常皮膚組中MMP9表達高者MVD表達亦高，且MMP9的高表達的部位與MVD高密度區(qū)具有一致性，均位于癌巢邊緣地區(qū)，提示：腫瘤的浸潤生長與新生血管生成是同步進行的，MMP9的表達與腫瘤血管形成有關(guān).本研究結(jié)果表明，SCC的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞的分化程度及新生血管的密度密切相關(guān)，MMP9可能是SCC的重要促血管生成因子之一.阻斷MMP9的表達，抑制MMP9的活化可能對抑制SCC轉(zhuǎn)移具有重要意義.
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EffectofVHLmRNAandFIH1mRNAexpressionsincolorectalcarcinomaonHIF1αproteinlevel
【Abstract】AIM:TodetectmRNAexpressionsofVHLandFIH1incolorectalcancer,andexploretheireffectonHIF1αproteinlevel.METHODS:SemiquantitativeRTPCRassaywasusedtodetecttheexpressionsofVHLmRNA,FIH1mRNAin42patientswithcolorectalcancer;ExpressionofHIF1αproteinwasmeasuredbySPimmunohistochemistry;Spearmanrankcorrelationwasusedtoanalyzethecorrelationbetweenthem.RESULTS:mRNAlevelsofVHLandFIH1incolorectalcancerweresignificantlylowerthanthoseinadjacenttissue（t=-10.14,P=0.00；t=-15.26,P=0.00）；BothexpressionsdecreasedasDukesstageincreased,andtheexpressionsinDukesA+BstageweresignificantlyhigherthanthoseinDukesC+Dstage（t=2.84,P=0.01；t=-5.13,P=0.00）；Theirexpressionshadnorelationshipwithtumorlocationandgender.In42casesofcolorectalcancer,positiverateofHIF1αproteinwas69.1%(29/42),theexpressioninDukesC+Dstage(80.0%,24/30)wassignificantlyhigherthanthatinDukesA+Bstage(41.7%,5/12),(t=5.89,P=0.02);itwasnegativeinadjacenttissue;SpearmanrankcorrelationdisplayedthattheexpressionsofVHLmRNAandFIH1mRNAwerenegativelycorrelatedwiththeHIF1αproteinlevel(rs=-0.97,P=0.01;rs=-0.66,P=0.01).CONCLUSION:TheoverexpressionofHIF1αmayplayanimportantroleinthedevelopmentandmatastasisofcolorectalcancer；ThedecreaseofVHLmRNAandFIH1mRNAexpressionsiscloselycorrelatedwiththeincreaseofHIF1αproteinlevelincolorectalcancer.
【Keywords】colorectalneoplasms;HIF1α;VHL;FIH1
【摘要】目的：檢測大腸癌中VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA以及HIF1α蛋白的表達,探討VHL，F(xiàn)IH1對HIF1α蛋白水平的影響.方法：采用RTPCR技術(shù)檢測42例大腸癌組織和相應(yīng)的癌旁正常粘膜組織中VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA的表達，采用免疫組化SP法檢測HIF1α蛋白在大腸癌和癌旁正常組織中的表達，Spearman相關(guān)關(guān)系檢驗分析其之間的相關(guān)性.結(jié)果：大腸癌組織VHLmRNA和FIH1mRNA的表達水平顯著低于癌旁正常組織（t=-10.14,P=0.00；t=-15.26,P=0.00）；二者的表達水平隨Dukes分期而降低，DukesA+B期顯著高于DukesC+D期（t=2.84,P=0.01；t=-5.13,P=0.00）；它們的表達水平與與腫瘤部位、性別無關(guān).大腸癌組織HIF1α蛋白表達陽性率為69.1%(29/42),在癌旁正常組織中均為陰性；DukesC+D期(80.0%,24/30)顯著高于DukesA+B期(41.7%,5/12),(t=5.89,P=0.02)；Spearman相關(guān)分析顯示，HIF1α表達水平與VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA的表達水平顯著負相關(guān)（rs=-0.97,P=0.01，rs=-0.66,P=0.01）.結(jié)論：HIF1α的過表達在大腸癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，大腸癌組織中VHL以及FIH1的水平下降與HIF1α蛋白水平的升高之間存在密切相關(guān).
【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸腫瘤；低氧誘導(dǎo)因子1α；VHL基因；缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子1
低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxiainduciblefactor1，HIF1）在低氧狀態(tài)下通過對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)控著血管發(fā)生、紅細胞生成以及糖酵解等過程［1］.希佩爾林道病(vonHippelLindau,VHL)希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白(proteinvonHippelLindau,pVHL)在依賴于氧的條件下作用于HIF1的α亞單位，促使其發(fā)生泛素化和蛋白酶體的降解［2］.低氧誘導(dǎo)因子1抑制因子(factorinhibitingHIF1,FIH1)能結(jié)合HIF1α并抑制其轉(zhuǎn)錄激活功能［3］.我們采用RTPCR法檢測了大腸癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織中VHLmRNA,FIH1mRNA的表達水平，同時采用免疫組化方法檢測HIF1α蛋白的表達，并進一步分析探討它們之間的相關(guān)性.
1材料和方法
1．1材料甘肅省人民醫(yī)院肛腸科200410/200504手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的新鮮大腸腺癌標(biāo)本42(男27，女15)例，年齡31～76（中位56)歲.其中結(jié)腸癌7例，直腸癌35例.DukesA期5例，B期7例，C期18例，D期12例(有7例發(fā)生轉(zhuǎn)移),術(shù)前未做化放療.同時距腫瘤邊緣5～10cm以上切取正常組織作為自身對照.標(biāo)本離體后5min內(nèi)即投入液氮罐并轉(zhuǎn)至-80℃冰箱凍存.RNA提取試劑,飽和酚,100bpDNAladder購自上海生工;逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV(RNaseH)，Taq酶，AgaroseGel，MMLVRtasecDNAsynthesisKit(codeD6130)，RNA酶抑制劑，瓊脂糖（Agarose）均購自大連寶生物公司;兔抗人HIF1α多克隆抗體購自武漢博士德公司;生物素鏈霉素抗生物素蛋白檢測系統(tǒng)(SP)試劑盒均購自福州邁新公司;根據(jù)從NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中所查到VHL和FIH1mRNA序列，經(jīng)計算機輔助設(shè)計引物，內(nèi)參對照選用磷酸甘油醛脫氫酶(Gapdh).引物均由上海生工合成，使用濃度均50μmol/L(表1).
1．2方法
1．2.1VHL及FIH1的RTPCR檢測從-80℃冰箱中取出凍存的新鮮組織(癌及癌旁正常組織)200mg，采用Trizol法提取組織總RNA，測定總RNA濃度及純度.使用Takara的MMLVRtasecDNAsynthesisKit(codeD6130)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1鏈，接著合成第2鏈（均照說明書操作）.將所得30μL產(chǎn)物凍存于-20℃以備進行PCR.PCR反應(yīng)體系50μL，包括10×Buffer5μL,25mmoldNTPmixture0.5μL,TaqDNA酶1μL，目的引物（VHL或FIH1）上下游各1μL，Gapdh引物上下游各1μL，cDNA模板1μL，無菌水38.5μL.反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s,退火30s(退火溫度VHL55℃,FIH158℃)，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃10min后終止反應(yīng).PCR產(chǎn)物于20g/L的瓊脂糖凝膠做電泳,以無菌水代替cDNA模板的PCR管為陰性對照，天能凝膠成像系統(tǒng)對電泳條帶拍照并進行半定量分析.VHLmRNA,FIHmRNA相對表達量以同一反應(yīng)體系中目的產(chǎn)物電泳條帶密度指數(shù)與內(nèi)參對照Gapdh電泳條帶密度指數(shù)的比值來表示.
1.2.2HIF1α免疫組化染色取出凍存的新鮮標(biāo)本迅速置于40g/L甲醛中固定，制成石蠟塊.先行HE染色確定,取標(biāo)本無出血、壞死區(qū)域,組織厚度5μm連續(xù)切片,HIF1α稀釋度1∶50,SP法染色，用PBS液代替一抗作陰性對照.DAB作底物顯色,蘇木素復(fù)染核,梯度酒精脫水,二甲苯透明,樹脂膠封片,顯微鏡下觀察.HIF1α判斷標(biāo)準按文獻［4］:陽性細胞胞核呈棕黃色顆粒著色,陰性(-)為腫瘤組織完全不著色或陽性細胞數(shù)<5%；陽性(+)為腫瘤組織陽性細胞數(shù)的范圍為5%～25%；陽性()為腫瘤組織陽性細胞數(shù)的范圍為>25%～50%；陽性()為腫瘤組織陽性細胞數(shù)>50%.
統(tǒng)計學(xué)處理:數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗.計數(shù)資料兩組率的比較采用四格表的校正卡方檢驗，RTPCR結(jié)果和免疫組化結(jié)果的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，按α=0.05的水準判斷是否具有統(tǒng)計學(xué)意義.
2結(jié)果
2．1RTPCRVHLmRNA在大腸癌組織中的表達水平為0.51±0.08，癌旁正常組織中的表達水平為0.63±0.11，配對t檢驗結(jié)果顯示差異有顯著性（t=-10.14,P=0.00）；FIH1mRNA在大腸癌組織中的表達水平為0.52±0.05，癌旁正常組織中的表達水平為0.60±0.14，配對t檢驗結(jié)果顯示差異有顯著性（t=-15.26,P=0.00）.VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA表達水平與發(fā)病部位，性別，Dukes分期以及有無轉(zhuǎn)移等臨床病理資料之間有關(guān)(圖1,2,表2).表2大腸癌組織VHLmRNA與FIH1mRNA的表達與臨床病理的關(guān)系
2．2免疫組化染色癌旁正常組織HIF1α免疫組化染色均為陰性（圖3）；癌組織中29例（69.1%）HIF1α陽性(圖4)，其中(+)16例，()10例，()3例.HIF1α表達與Dukes分期明顯相關(guān)，DukesA+B期和DukesC+D期的陽性率分別為41.7%(5/12),80.0%(24/30),兩者差異具有顯著性(P<0.05).無轉(zhuǎn)移者HIF1α陽性率為65.7%(23/35),有轉(zhuǎn)移者陽性率為85.7%(6/7),兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義.
2．3VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA表達與HIF1α蛋白水平的關(guān)系我們采用非參數(shù)檢驗的Spearman等級相關(guān)分析，結(jié)果顯示，大腸癌組織中HIF1α表達水平與VHLmRNA和FIH1mRNA的表達水平呈顯著負相關(guān)(rs=-0.97,P<0.01；rs=-0.66,P<0.01).圖3癌旁正常組織HIF1α的表達SP×400
3討論
HIF1是一個異二聚體，由對氧敏感的α亞單位(HIF1α或HIF2α)和組成性表達的β亞單位(HIF1β,也稱之為芳香烴受體核轉(zhuǎn)位分子，ARNT)構(gòu)成［5］.HIF1調(diào)節(jié)通路的失調(diào)對于癌癥以及缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響作用［6］.VHL基因定位于染色體3p2526區(qū)域,包含3個外顯子，編碼由284個氨基酸殘基組成的pVHL［7］.FHI1基因定位于染色體10q24，它在生物工程信息數(shù)據(jù)庫國家中心的基因座ID為55662.此基因有8個外顯子，全長14kb，可以編碼一種特異性的天冬酰胺羥化酶，屬于2酮戊二酸依賴性雙加氧酶家族［8］.我們用RTPCR法檢測了大腸癌和癌旁正常組織中VHLmRNA和FIH1mRNA的水平，同時用免疫組化法檢測了HIF1α蛋白在癌組織和癌旁正常組織中的表達.結(jié)果表明，VHLmRNA和FIH1mRNA在癌組織中的表達水平顯著低于癌旁正常組織；二者的表達水平隨Dukes分期而降低，DukesA+B期顯著高于DukesC+D期；FIH1mRNA在有轉(zhuǎn)移的病例中顯著低于無轉(zhuǎn)移的病例；它們的表達水平與與腫瘤部位、性別無關(guān).而HIF1α蛋白表達在癌組織中總陽性率為69.1%(29/42),在癌旁正常組織中均為陰性；在DukesC+D期顯著高于DukesA+B期；HIF1α蛋白的表達在轉(zhuǎn)移的病例中高達85.7%(6/7)，而未轉(zhuǎn)移者為68.6%(23/35)，但卻無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是樣本量過少的緣故.
Spearman等級相關(guān)分析顯示，HIF1α表達水平與VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA的表達水平顯著負相關(guān)，這表明大腸癌組織中抑癌基因VHL以及FIH1的水平下降與HIF1α蛋白水平的升高之間存在密切相關(guān).HIF1α的過表達在大腸癌的發(fā)生發(fā)展，浸潤轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，HIF1α高表達的癌組織具有較強的浸潤和轉(zhuǎn)移能力.提示HIF1α的表達可反映結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為，可以作為判斷結(jié)直腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的有價值指標(biāo).此外，低氧適應(yīng)性反應(yīng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，而HIF1α是此過程中的樞紐環(huán)節(jié)，利用反義核酸抑制HIF1α的轉(zhuǎn)錄活性已經(jīng)成為治療腫瘤的一個重要切入點［9-11］，隨著對VHL和FIH1作為HIF1α負性調(diào)節(jié)子功能的逐步闡明［12］，進一步探討聯(lián)合應(yīng)用VHL基因治療和FIH1的擬似物，以降低HIF1α的表達和轉(zhuǎn)錄活性，抑制癌細胞的低氧適應(yīng)反應(yīng)，在防治大腸癌的發(fā)生發(fā)展，浸潤轉(zhuǎn)移方面將會有更廣闊的前景.
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1．1教學(xué)方式的改革
在教學(xué)方式上，突破“學(xué)校本位、課堂本位、教師本位”的模式。將單純的“教師講、學(xué)生聽”的注入式教學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)椤皩W(xué)為主、教為導(dǎo)”的方式，在講解基本知識的基礎(chǔ)上，開展討論式、啟發(fā)式、總結(jié)式的上課形式，達到教與學(xué)的互動，使學(xué)生在主動、雙向、探索的過程中得到發(fā)展，從而提高學(xué)生的創(chuàng)新能力。如在臨床檢驗基礎(chǔ)實驗課中，在血常規(guī)檢驗中，要求學(xué)生自己制作血涂片，并且分析結(jié)果，每組學(xué)生分別對自己的實驗結(jié)果進行討論，按照復(fù)檢規(guī)則進行復(fù)檢，最終將結(jié)果報告出來，提高學(xué)生的動手及分析結(jié)果的能力，為臨床實習(xí)打下基礎(chǔ)。
1．2教學(xué)手段的改革
改革教學(xué)手段，充分利用文學(xué)、聲像、電子和多媒體等技術(shù)開展日常教學(xué)工作，增加學(xué)生獲取知識的現(xiàn)代化手段，調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，培養(yǎng)學(xué)生主動發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力。同時利用網(wǎng)絡(luò)資源(校園網(wǎng)和互聯(lián)網(wǎng)等)，開展網(wǎng)絡(luò)課程教學(xué)。在臨床分子生物學(xué)檢驗的實驗課教學(xué)中，要求學(xué)生在網(wǎng)絡(luò)上進行基因查找，及相關(guān)論文的搜索，讓學(xué)生學(xué)會利用互聯(lián)網(wǎng)巨大的知識平臺，完成對知識的獲取，并且取得了一定的效果。
1．3鼓勵學(xué)生參與科研活動，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力
鼓勵教師在教學(xué)過程中向?qū)W生介紹與教學(xué)相關(guān)內(nèi)容的前沿進展，開拓學(xué)生的視野，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣;讓學(xué)生參與教師的科研工作，拓寬知識面，歷練實驗操作技能，以科研帶動實驗技能培養(yǎng)，促進學(xué)生的創(chuàng)新能力培養(yǎng)和科研能力的提高;鼓勵學(xué)生積極申請“大學(xué)生創(chuàng)新基金”課題，定期舉行科研知識講座，提高學(xué)生的科研素質(zhì)的同時，也鍛煉了學(xué)生的實踐能力。
2實踐教學(xué)環(huán)節(jié)的改革
2．1加強學(xué)生動手能力的培養(yǎng)
除了與理論課同步的實驗課之外，增加綜合能力訓(xùn)練與考核、技能訓(xùn)練與考核，如定期組織臨床檢驗技能大賽，使學(xué)生掌握崗位必需的實際操作技能;同時除了最后一年的臨床實習(xí)外，在學(xué)習(xí)專業(yè)課時，還設(shè)置了周末去附屬醫(yī)院檢驗科實習(xí)的機會，以及增加了一門30學(xué)時的見習(xí)課，使學(xué)生具備常用儀器使用的技能和熟練使用臨床檢驗儀器設(shè)備，達到能上崗實習(xí)的目的。
2．2加強實驗教師的培訓(xùn)力度，提高實驗教學(xué)人員的技術(shù)水平
培養(yǎng)“三高一強(學(xué)歷高、職稱高、綜合素質(zhì)高、實踐教學(xué)能力強)”，一專多能的“創(chuàng)新性應(yīng)用型”教師隊伍。積極拓寬進修渠道，為青年教師創(chuàng)造參加國內(nèi)學(xué)術(shù)交流，外出參觀學(xué)習(xí)的機會。實行青年教師導(dǎo)師制，發(fā)揮名師傳、幫、帶作用。并要求青年教師每學(xué)期完成學(xué)習(xí)性聽課不少于40學(xué)時，不斷提高青年教師業(yè)務(wù)水平和綜合素質(zhì)。鼓勵教師和實驗技術(shù)人員開設(shè)創(chuàng)新性實驗，切實提高自身技術(shù)水平，促進實驗室建設(shè)和教學(xué)質(zhì)量的不斷提高。
2．3健全實踐教學(xué)管理監(jiān)督體系
健全實踐教學(xué)質(zhì)量管理監(jiān)督體系，建立起規(guī)范的實踐教學(xué)管理模式和機制。本著“既重視目標(biāo)管理，又重視過程管理”的思路，結(jié)合評估指標(biāo)體系和學(xué)校的實際情況及人才社會需求調(diào)研和畢業(yè)生質(zhì)量跟蹤調(diào)查的結(jié)果，修訂和規(guī)范實踐教學(xué)管理文件，加強實踐教學(xué)常規(guī)管理。將教學(xué)檢查與評估列為實踐教學(xué)管理的日常工作，進一步完善建立切實有效教學(xué)質(zhì)量保證和監(jiān)控體系、進一步加大學(xué)生評教、教師評學(xué)的參與力度。建立教師教學(xué)工作目標(biāo)管理體系，制定考核標(biāo)準，按標(biāo)準做到定量與定性考核相結(jié)合，提高考核結(jié)果的科學(xué)性，嚴格按照標(biāo)準做到定期考核與實時考核相結(jié)合，提高考核結(jié)果的有效性與科學(xué)性，進一步提高學(xué)生的實踐水平。
3改革的成效
